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科研小努力新蟲 (小有名氣)
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[交流]
蛋白提取純化常見問題？
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1、蛋白純化標(biāo)簽應(yīng)該如何選擇？ 在進行蛋白表達時，選擇合適的標(biāo)簽有利于蛋白的純化，促進蛋白的可溶性，因此了解幾種常用的蛋白純化標(biāo)簽很重要。 一般來說，常用的蛋白純化標(biāo)簽主要有His tag、GST tag、MBP tag、NusA tag、Strep tag，那么這些蛋白純化標(biāo)簽有什么不同之處呢？ His tag（組氨酸標(biāo)簽）融合蛋白是目前最常見的表達方式，其優(yōu)點是標(biāo)簽小，純化步驟簡便，純化條件溫和，能純化可溶性/包涵體蛋白，一般不會影響蛋白的功能結(jié)構(gòu)，且可以產(chǎn)出大量的目標(biāo)蛋白，但該標(biāo)簽不適合易氧化蛋白或膜蛋白的純化。 GST tag（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）的洗脫條件溫和，有助于保持蛋白功能活性，適合pull-down 檢測，具有很好的線性動態(tài)范圍，但分子量較大，可能會影響蛋白質(zhì)的功能和下游實驗，如果蛋白不可溶，很難用變性的方法進行純化。 MBP tag（麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽）可以減少目標(biāo)蛋白的降解，增加蛋白的表達量和穩(wěn)定性，提高表達產(chǎn)物的水溶性，但標(biāo)簽較大，對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能會有一定影響。 NusA tag（轉(zhuǎn)錄終止/抗終止蛋白標(biāo)簽）不具有獨立的純化標(biāo)簽功能，需要和其他標(biāo)簽（如His標(biāo)簽）聯(lián)用，可提高蛋白質(zhì)的溶解性，但由于分子量較大，對蛋白下游應(yīng)用會有影響。 Strep tag（strep標(biāo)簽）能產(chǎn)出高純度（95%）的目標(biāo)蛋白，且能保持目標(biāo)蛋白活性，主要是因其純化流程溫和。其次，能進行變性條件下的純化。在用于WB/ELISA，可偵測目標(biāo)蛋白。另外，還可固定目標(biāo)蛋白，檢測蛋白質(zhì)交互作用，或更進一步用以篩選治療用蛋白質(zhì)，或是工業(yè)用酵素。但Strep tag純化系統(tǒng)的價格相對His tag而言較高，所產(chǎn)出的目標(biāo)蛋白數(shù)相對較少。 2.利用疏水性質(zhì)，用反向 HPLC 方法分離的原理？ 反相和疏水都是依據(jù)物質(zhì)的極性來純化的，極性越強先出來，極性越弱越后出，洗脫疏水是高鹽吸附低鹽洗脫，反像是極性強的流動相吸附，降低它的極性洗脫，選擇主要是依據(jù)填料的特點以及樣品本身的特點而改變的。 疏水的填料疏水集團密度只是反相的 10%左右,其他的都是親水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基團,因此疏水一般需要高鹽吸附,低鹽洗脫,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脫是逐漸增加有機溶劑的量.由于以上的原因,疏水比反相要溫和,蛋白一般不變性,由于填料多為瓊脂糖凝膠,所以蛋白回收率高,而反相適合做分析多,也有做制備的,那也是一些分子量相對小的多肽,反相的回收率也低, 因為硅膠雜吸附的原因.疏水色譜是純化蛋白的另一個有力的工具。 3.重組蛋白A瓊脂糖凝膠 FF 能一次純化大量血清 IgG 嗎？如幾十毫升,如用環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠純化血清 IgG，先要偶聯(lián)其相應(yīng)配基如抗體或蛋白 A 是嗎？這里瓊脂糖凝膠用環(huán)氧活化的意義是什么？ 幾十毫升如果一次純化也就用幾十毫升的 重組蛋白 A 瓊脂糖凝膠 FF 就可以,也可以分兩三次純化,這都沒有問題,如果是你想做血清中的抗體純化也可以把抗原偶聯(lián)到環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠上, 這樣得到的抗體更純, 一般不選擇蛋白 A, 環(huán)氧活化便宜,而且相成的鍵很穩(wěn)定,沒有非特異吸附,是個不錯的方法。 4. 通過 His 標(biāo)簽純化的蛋白，雜帶比較多，如何改進？ （1）如果純化的是上清，蛋白酶會部分降解目的蛋白，可通過加多種蛋白酶抑制劑改進。 （2）可提高雜蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度，以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。 （3）雜蛋白和目的蛋白結(jié)合，可通過超聲前加入去垢劑的方式消除（1%-2%Tritonx-100）。 5. 鎳柱使用中出現(xiàn)棕色是怎么回事? 出現(xiàn)這樣的情況，主要是緩沖液中 DTT 的影響，DTT 會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下鎳離子會被 DTT 還原生成棕色的沉淀，所以所有鎳柱的生產(chǎn)商都強調(diào)要盡量避免 DTT 的參與（一般的鎳柱耐受小于 5mM DTT，推薦緩沖液中不要超 2mM DTT）。 6. 鎳柱堵了怎么辦？ （1）柱子發(fā)生堵塞，可能是樣品中細(xì)胞碎片或其他雜顆粒所致，所以樣品一定要高速離心，并過0.22或者0.45的膜。 （2）上清純化時，蛋白發(fā)生變性，有絮狀物產(chǎn)生，趕緊加入 1-2mM DTT （上清樣品處理要在冰浴中進行），還不行加尿素變性，使其在變形環(huán)境下。 （3）樣品處理時的料液比不要太小，否則黏度大，或者導(dǎo)致蛋白析出或變性，料液比要在 1/10-1/15 之間較適宜。 7. 純化過程中，蛋白出現(xiàn)了渾濁，怎么辦？ （1）出現(xiàn)渾濁，說明蛋白處在不穩(wěn)定的環(huán)境中或者自身就不穩(wěn)定，所以要檢查緩沖體系是否正確，環(huán)境是否低溫，或在緩沖液中加入還原劑 DTT。 （2）加入肌氨酸鈉，迅速使蛋白變性，消除渾濁現(xiàn)象。 8. 沒能純化到帶 His 標(biāo)簽的蛋白，蛋白都流穿了（未掛柱）？ （1）超聲的功率不對（太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放） 策略：改變超聲功率，并在超聲前加入溶菌酶。 （2）樣品或者是結(jié)合緩沖液不正確 ；策略：檢測 pH 及樣品和結(jié)合緩沖液的組成份。 （3）組氨酸的標(biāo)簽沒有完全的暴露 ；策略：在變性條件下（用 8M 脲，6M 鹽酸胍，1%SDS） 并加入 1-2mMDTT 進行純化。 （4）His 標(biāo)簽丟失；策略 1：WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達，上游構(gòu)建，改變 his-tag 的位（C-terminal orN-terminal），必要時增加 his 個數(shù)（常用 6-10 個）；策略 2：孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間；策略 3：改變螯合的金屬離子，尋找到最佳的結(jié)合金屬離子。 Ni2+通常是從宿主細(xì)胞蛋白中純化大多數(shù)（組氨酸）6 標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的首選金屬離子，也是一般最常用的離子。 蛋白和金屬離子之間的結(jié)合強度受幾種因素影響，包括長度、位置、親和標(biāo)記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH，因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 來篩選不同的金屬離子。 9. 蛋白掛在柱子上洗脫不下來，怎么解決？ （1）洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強） 策略：用增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。 （2）降低 PH 的方法洗脫的，因為若 PH 低于 3.5，會導(dǎo)致鎳離子脫落策略：改變洗脫辦法，咪唑競爭性洗脫。 （3）蛋白已沉淀在柱上策略：減少上樣量和孵育的時間，試用去污劑（1%-2%Tritonx-100）或改變 NaCl 的濃度，或在變性條件下洗脫（用 8M 脲，或 6M 鹽酸胍），最終也可在洗脫 Buffer 中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸鈉進行洗脫。 （4）非特異性疏水或其他相互反應(yīng)策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X-100）或增加 NaCl 的濃度。 10. 如何處理樣品，可使其初步提純（如何洗去蛋白的自身帶）？ （1）上清樣品處理，要加入去污劑，蛋白酶抑制劑，還原劑，還要注意溫度及超聲破碎的參數(shù)。 （2）去大腸桿菌自身帶（兩條 30KD-40KD）可用非變性緩沖液超聲懸�。尤肴ス竸�，離心 6000r/min，30min，10℃。（若效果不夠可繼續(xù)上述步驟）。 （3）大腸桿菌包涵體的洗滌，可用包涵體洗液多洗幾遍，也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解，可選取其中純度最佳的。 （4）可用硫酸銨沉淀法，初步提純。 |
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