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科研小努力新蟲 (小有名氣)
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[交流]
Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)步驟
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1. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 提前12 h將Matrigel放到4℃融化，將實(shí)驗(yàn)用到的槍頭、EP管等材料提前放到-20℃預(yù)冷；實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備冰盒，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程置于冰上進(jìn)行； 2. 包被基底膜 在冰上將Matrigel膠用無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，混勻后加入小室中，注意動(dòng)作輕柔，不要產(chǎn)生氣泡，將小室放入CO2培養(yǎng)箱中孵育2h備用； 3. 水化基底膜 將孵育完成的小室中上室多余的液體小心吸掉，每孔中加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中放置30 min。 4. 接種細(xì)胞 a. 將狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行消化，離心，用PBS洗1-2遍，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1-10×105/ml（需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定具體的細(xì)胞密度）； b. 在下室中加入500μL的含10%FBS的培養(yǎng)基，將小室小心放入24孔板內(nèi)，在上室中加入細(xì)胞懸液100 μL-200 μL，放入培養(yǎng)箱中（需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定具體的培養(yǎng)時(shí)間）。 5. 固定染色、拍照及計(jì)數(shù) a. 到時(shí)間點(diǎn)后將小室取出，用PBS清洗小室，用棉簽輕柔擦去上室細(xì)胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲醇20 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。 b. 將小室置于顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)。 |
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