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想要搞科研新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助！無縫克隆兩個問題 已有2人參與
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1求助為什么無縫克隆一直都連不上��？ 引物設(shè)計的沒有問題 濃度配比也試了很多 板長都不長，不是長了菌檢沒有條帶 2大搖完的菌液可以用小提試劑盒嘛？ 還是必須用小搖的菌 @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 [ Last edited by 想要搞科研 on 2023-9-13 at 12:29 ] |
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5樓2023-09-18 14:40:12
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【答案】應(yīng)助回帖
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問題1：相信整個實驗流程應(yīng)該沒有問題，但大概率是實驗細節(jié)沒有注意到，導(dǎo)致反復(fù)多次仍然無法成功。具體原因可能是： 1）目的片段回收后有乙醇殘留：在加水洗脫前充分晾干； 2）受感受態(tài)狀態(tài)影響：-80℃取出感受態(tài)應(yīng)立即放在冰上融化，不要穿梭實驗室； 3）同源重組后產(chǎn)物與感受態(tài)混合過于劇烈：在冰上輕輕吹打混勻； 4）熱擊后立即進行下游實驗：應(yīng)在冰上放置2~3分鐘； 5) 菌液活化采用加了抗生素的LB培養(yǎng)基：熱擊將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)，還沒有進行抗性基因表達，加了抗生素后直接就把細菌殺死了，更換為無抗性的LB培養(yǎng)基即可； 6）LB固體平板中抗生素濃度過高：適當(dāng)降低對應(yīng)抗生素濃度。 問題2：大搖后的菌液是可以用小提試劑盒抽提，但是小提試劑盒柱子承載不了那么多的質(zhì)粒，過飽和會導(dǎo)致很多質(zhì)粒就浪費掉了。換言之，如果采用小提試劑盒抽提大搖菌液的話，需要將菌液進行分量提取。 |
7樓2023-09-28 08:42:00
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