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28968058wj新蟲 (小有名氣)
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[交流]
細胞器內(nèi)蛋白質(zhì)的制備
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細胞器內(nèi)蛋白質(zhì)的制備 在生物體內(nèi),細胞區(qū)隔化使得不同的細胞器擁有各自的蛋白質(zhì)系統(tǒng)。細胞器是一種動態(tài)的結構,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核和高爾基體等,其組成蛋白質(zhì)中,除了駐留蛋白質(zhì)之外,還包括穿梭蛋白質(zhì)和瞬間相互作用的蛋白質(zhì)。隨著近年來分子生物學、分子遺傳學、遺傳工程等學科的發(fā)展,對各種細胞器所包含的生物大分子,如核酸、蛋白質(zhì)等的研究工作日益增多,分離各種細胞器上的各類特異性蛋白質(zhì)已成為生物大分子制備工作的重要內(nèi)容,掌握這些蛋白質(zhì)的特異性有助于了解其特定功能,并對細胞器的功能作深入的闡述,同時還可獲得細胞器蛋白質(zhì)的定位信息,有助于進一步認識亞細胞器蛋白質(zhì)組。 根據(jù)實驗需要來制備某種生物大分子時,通常先破碎細胞后,再分離細胞器,最后采用相應方法獲得需要的生物大分子組分。 1、細胞的破碎 分離亞細胞組分的第一步是細胞破碎,實驗中多采用比較溫和的破碎方法,且可用顯微鏡監(jiān)控以確保細胞器的結構完整。較多采用的是制備組織勻漿或細胞勻漿的方法。勻漿(homogenization)是在低溫條件下,將組織或細胞放在勻漿器中加入等滲勻漿介質(zhì)(即0. 25 mol/L蔗糖及0. 003 mol/L氯化鈣溶液)研磨,使細胞被機械地研碎成各種亞細胞組分和內(nèi)容物的混合液。 2、亞細胞組分的分離 亞細胞組分的分離需要采用分級分離方式,主要是利用由低速到高速的離心技術,使非均一混合體中的顆粒按其大小和密度不同分批沉降到離心管的不同部位,再分部收集,即可得到各種亞細胞組分。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布于整個離心管中,故每級分離得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒,須經(jīng)反復懸浮和離心加以純化。分離亞細胞組分主要的離心技術是差速離心和密度梯度離心。 (1)差速離心(differential centrifugation) 在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心,用于分離不同大小的細胞和細胞器。在差速離心中細胞器沉降的順序一般依次為:細胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、高爾基體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng),最后為核蛋白體。 由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中,一般需要重復2-3次才能獲得比較理想的效果。通過差速離心初步分離的細胞器,常需通過密度梯離心進一步分離純化。 差速離心圖解 差速離心圖解 (2)密度梯度離心(density gradient centrifugation) 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細胞的混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過重力或離心力的作用使細胞分層、分離。 在實際操作中,一般是將差速離心與密度梯度離心聯(lián)用,即勻漿產(chǎn)生的細胞裂解物通過一系列差速離心步驟加密度梯度離心來分離細胞器等顆粒。 3、亞細胞組分的分析確認 分離亞細胞組分的第三步是對分離得到的組分進行分析、確認。常用的分析 方法包括形態(tài)和功能的鑒定。 4、注意事項及建議 (1)在細胞器的提取過程中,要制定針對不同細胞器的提取方案,提取過程中注意保證其完整性,并在提取結束時先進行細胞器完整性的檢驗。 (2)細胞器的提取中引入的試劑可能會影響到后續(xù)的蛋白質(zhì)提取等實驗,需要在方案設計時一并考慮。 (3)蛋白質(zhì)提取過程中需要注意對蛋白質(zhì)的保護,有些蛋白質(zhì)易被降解,可添加蛋白酶抑制劑、還原劑等,并盡量保持在低溫條件下操作。 |
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