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值得收藏，細胞破碎技術攻略大全！
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在生物學研究中，除了某些細胞外的多肽激素和某些蛋白質(zhì)與酶以外，經(jīng)常會對細胞或組織進行破碎處理，使生物大分子充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性，最終目的是獲得細胞內(nèi)的物質(zhì)。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。 01 組織器官破碎方法 No.1 機械破碎 （1）研磨：研磨是將剪碎的動物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，即可將動物細胞破碎，這種方法比較溫和，適宜實驗室使用。工業(yè)生產(chǎn)中可用電磨研磨。細菌和植物組織細胞的破碎也可用此法。 （2）勻漿：勻漿這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通�？上扔眉矣檬称芳庸C將組織打碎，然后再用10000r/min-20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機（即高速分散器）將組織的細胞打碎，為了防止發(fā)熱和升溫過高，通常是轉(zhuǎn)10秒-20秒，停10秒-20秒，可反復多次。 （3）膠體磨：膠體磨的基本原理是流體或半流體物料在離心力的作用下，強制通過高速相對運動的定齒與動齒之間，使物料受到強大的剪切力，磨擦力、高頻振動和高速旋渦等復雜力等作用，有效地被粉碎、乳化、均質(zhì)、混合，從而達到精細超微的效果。定轉(zhuǎn)子間的高速相對運動是使膠體磨工作獲得物理微細度的主要條件，只有提高磨盤的精密度與線速度，才能達到良好的加工效果。 No.2 物理破碎 （1）壓榨：壓榨是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000×105Pa-2000×105Pa的高壓下使幾十毫升的細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。這是一種較理想的破碎細胞的方法，但儀器費用較高。 （2）冷熱交替：冷熱交替是在90℃左右維持數(shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎，細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時可用此技術。 （3）反復凍融：反復凍融是將待破碎的細胞冷至15℃-20℃，然后放于室溫（或40℃）迅速融化，如此反復凍融多次，由于細胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細胞破碎。 （4）超聲波：超聲波是借助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些，處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關。使用時注意降溫，防止過熱。 No.3 化學與生物化學破碎 （1）有機溶劑：有機溶劑是利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此技術也可以與研磨法聯(lián)合使用。 （2）自溶：自溶是將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當?shù)臏囟认�，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來，此法稱為自溶法。該法使用時要特別小心操作，因為水解酶不僅可以使細胞壁和膜破壞，同時也有可能會把某些要提取的有效成分分解。 （3）溶脹：溶脹是在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內(nèi)含物。 （4）酶解：酶解是利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，可以專一性地將細胞壁分解，釋放出細胞內(nèi)含物，酶解破碎適用于多種微生物。例如從某些細菌細胞提取質(zhì)粒DNA時，可采用溶菌酶（來自蛋清）破細胞壁，而在破酵母細胞時，常采用蝸牛酶（來自蝸牛），將酵母細胞懸于0.1mmol/L檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液（pH=5.4）中，加1%蝸牛酶，在30℃處理30分鐘，即可使大部分細胞壁破裂，如同時加入0.2%疏基乙醇效果會更好。此法可以與研磨聯(lián)合使用。 02 細胞破碎方法 No.1 高速組織搗碎 將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。 No.2 玻璃勻漿器勻漿 先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。 No.3 超聲波處理法 用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。 No.4 反復凍融法 將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。 No.5 化學處理法 有些動物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。 總之，無論用哪一種方法破碎組織細胞或組織，最終目的都是使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。 |
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