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想要構建脈絡膜新生血管模型，要注意哪些？
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脈絡膜新生血管(choroidal neovascularition，CNV)又名視網膜下新生血管，是來自正常脈絡膜組織的增殖血管，可通過Bruch膜破損處進入Bruch膜與視網膜色素上皮層(retinal pigment epithelium，RPE)之間、視網膜神經上皮層與RPE之間、RPE與脈絡膜之間。CNV是許多脈絡膜視網膜疾病，如年齡相關性黃斑變性滲出期、高度近視黃斑變性等發(fā)生發(fā)展中的重要病理機制。為了進一步發(fā)現這些疾病確切的發(fā)病機理，制作接近臨床特征的CNV動物模型是必要的前提。 目前，動物模型主要有3種，激光誘導動物模型、生長因子誘導的動物模型、基因缺陷動物模型。其中激光誘導的CNV模型應用最為廣泛。 動物的選擇 主要有鼠、兔和猴等。鼠是目前誘導CNV模型應用最廣泛的實驗動物。 鼠 鼠誘導CNV的發(fā)生率較高，大約有60％～70％在光凝后短時間（1周）內即可產生，而且光凝斑熒光滲漏10～14天達到高峰，便于進行干預性研究；誘導CNV的條件也可標準化，價格相對便宜，便于基因操作，可用于觀察單一基因過表達或低表達對CNV生成的影響。 不足之處是FFA中觀察到的新生血管滲漏率低，僅為28％，且鼠的眼球較小，操作技術要求高。大鼠和小鼠CNV的誘發(fā)率無明顯差異，小鼠眼球更小，操作要求更高，更適于進行有關基因敲除方面的研究。 猴 實驗性猴CNV模型與人類疾病改變極為相似，不僅組織學改變一致，在眼底熒光素血管造影（FFA）中也具有熒光素滲漏的特征。這種新生血管一般發(fā)生在激光光凝后4周，可持續(xù)2～52周。增生移行的RPE細胞包繞新生血管后，新生血管熒光素滲漏的表現會越來越不明顯。 盡管這種模型得到了一致的認可，但動物來源受限，費用較高，CNV誘發(fā)時間較長，發(fā)生率低，限制了其應用。 兔 兔產生的CNV在FFA中不具有熒光素滲漏的特征，加之考慮到兔的眼底血循環(huán)結構與人類有較大的差異，目前已基本不用兔做此類模型。 造模方法 一、激光誘導動物模型 造模方法： 健康棕色挪威大鼠，雄性，體質量180-200g，10%水合氯醛(0.35mL/100g體質量)腹腔注射麻醉。復方托吡卡胺滴眼液點眼散瞳。眼前放置滴加少量 1%甲基纖維素的蓋玻片接觸角膜，氪激光(波長647nm，光斑直徑50um，功率360mW，曝光時間0.05s)距視盤2~3個視盤直徑均勻光凝9個點，以見到有氣泡產生提示Bruch膜被擊穿為準。 FFA的觀察： 光凝后第3、7、14、21、30d隨機選取4只大鼠行FFA檢查。散瞳及麻醉方法同前，10%熒光素鈉注射液0.5mL/kg腹腔注射后立即行FFA。FFA圖像符合以下特點即認為CNV形成，①在造影早期即動脈前期或動脈期即顯影。②與視網膜血管系統(tǒng)沒有聯系。③熒光素迅速滲漏，有一定的積存范圍，后期形成高熒光區(qū)。將各時間段出現CNV光凝斑數目與該時間段的光凝斑總數的比值作為該時段的CNV發(fā)生率。 后續(xù)進行光鏡觀察、組織病理學CNV相對厚度測量、透射電鏡觀察。 優(yōu)點： 激光誘導的CNV動物模型發(fā)生率較高，大約為 60%~70%，在光凝后短期時間（7d）內即可產生，而且激光斑的熒光素滲漏在 10~14d達到高峰，便于進行干預性研究；誘導CNV的條件也可標準化，價格相對便宜，是目前眼科誘導CNV最常用的動物模型。 二、生長因子誘導CNV模型 包括視網膜下注射載有血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的腺相關病毒載體、重組VEGF明膠微粒誘導CNV模型、視網膜下注射堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）凝膠微粒誘導兔CNV模型、視網膜下注射bFGF/脂多糖誘導兔CNV模型、脈絡膜上腔植入bFGF微滲透泵誘導豬CNV模型等。其中視網膜下注射載有VEGF基因的腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體誘導CNV模型是較為理想的模型。 造模方法1： 將2μl編碼人 VEGF-A165腺病毒注射到大鼠視網膜下，CNV發(fā)生率為95%。 造模方法2： 在兔眼視網膜下注射5×106IU載有過表達VEGF-A165腺病毒載體誘導CNV模型，CNV發(fā)生率為83%。 三、轉基因或基因敲除誘導 轉基因和基因敲除建立CNV模型是一種新興技術，針對CNV發(fā)展的關鍵因素建立基因工程模型，可從不同角度分析各分子對CNV形成的影響，包括： （1）VEGF164RPE65轉基因小鼠； （2）雙倍體（Tet/VMD2/VEGF）和三倍體（Tet/VMD2/VEGF/An2）轉基因小鼠，視網膜可高表達VEGF，若同時視網膜下注射血管生成素2（angiogenin2，Ang2），能夠100%形成CNV； （3）趨化因子CC類受體2（chemokine CC motif receptor 2，CCR2）/趨化因子CC類配體2（chemokine CC motif ligand 2，CCL2）基因缺失誘導小鼠CNV模型，其成模率大約25％； （4）載脂蛋白E基因（apolipoprotein E，ApoE）過表達小鼠CNV模型是研究AMD病變中自發(fā)性CNV形成機制的重要模型； （5）CCL2和CX3C趨化因子受體1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1）基因缺陷小鼠； （6）超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）基因缺陷老化小鼠； （7）極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）定向突變小鼠； （8）視紫紅質基因啟動子/VEGF過表達小鼠。 優(yōu)缺點： 轉基因或基因敲除誘導的CNV模型具有誘導快，發(fā)生時間短等優(yōu)點，與CNV病理生理學關聯性強，對CNV發(fā)生機制的研究具有針對性，同時研究者可根據不同需求選擇模型并修改參數；缺點有CNV誘導率低、面積小、價格貴等問題。 總結 在眾多建立CNV模型的方法中，激光誘導CNV模型條件較成熟，研究歷史久，可靠性高，應用廣泛。由于動物體內環(huán)境不同于人體內環(huán)境，各種方法誘導的CNV動物模型也僅能模擬人類CNV，不能完全代替人類CNV發(fā)展的自然過程，因此，研究結果僅能為CNV發(fā)病和機制研究提供實驗理論依據。 |
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