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動物造模 | 深靜脈血栓動物模型的構(gòu)建
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靜脈血栓（Deep vein thrombosis，DVT）是多種因素引起的靜脈血栓性疾病，是目前臨床常見疾病并發(fā)癥之一。該病發(fā)病率高，危害性大。靜脈血栓成因復(fù)雜，主要有遺傳因素、創(chuàng)傷、血液粘度增大、長期固定、血管內(nèi)皮功能異常等。目前血栓的發(fā)生發(fā)展的具體信號傳導(dǎo)通路還不完全明確，研究血栓形成的信號傳導(dǎo)通路、標(biāo)志性的早期預(yù)警因子及預(yù)防、治療的藥物的研發(fā)都離不開動物模型。所以如何高效合理建立靜脈血栓動物模型有助于深入探索深靜脈血栓形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的病理過程和分子機(jī)制，并有助于研究早期預(yù)警、治療方法和藥物選擇。 目前制備深靜脈血栓動物模型的方法很多，主要是依據(jù)血流淤積、靜脈內(nèi)皮損傷和血液高凝狀態(tài)進(jìn)行制備DVT動物模型。具體選用何種動物及制備方法需根據(jù)具體的實驗要求和條件選擇。 動物的選擇 實驗動物的選擇與實驗結(jié)果息息相關(guān)，一般主要選擇與人類基因較為密切的活體動物，但隨著對DVT研究的目的、條件不同，對動物的選擇也有差異，這些差異還包括人與動物體型大小、壽命、血管大小和規(guī)格等差異。DVT研究對模型動物的要求主要體現(xiàn)在四方面：一要考慮DVT發(fā)展過程（急性、慢性、亞急性）的不同在動物身上的體現(xiàn)；二要確保動物模型形成的血栓穩(wěn)定可靠，且與人體靜脈血栓形成的病理過程一致；三要保證造模動物成活率高，存活時間長；四要考慮實驗動物是否易管理、易飼養(yǎng)、費(fèi)用高低等問題。選擇時應(yīng)綜合評判，目前常用于DVT造模的動物如下： 小鼠 小鼠繁殖能力強(qiáng)且周期快，是生命科學(xué)研究中最常用來造模的動物。小鼠常用于DVT的研究，其優(yōu)勢在于易獲取、價格低、飼養(yǎng)方便、適應(yīng)能力強(qiáng)、造模時間短，代謝率高。有研究者認(rèn)為鼠模型，尤其是涉及腎靜脈平面以下的下腔靜脈模型，技術(shù)操作簡單，實驗成功率也高，且廣泛應(yīng)用于急性和慢性DVT的研究。但小鼠模型也有其局限性：小鼠體積小，下腔靜脈較細(xì)，且沒有瓣膜，多用血管結(jié)扎手法造模，形成的血栓采集困難，且血流動力學(xué)、血管大小、凝血及演變過程與人類DVT形成及演變必然存在一定的差異。 其他鼠類 包括大鼠和裸鼠等。大鼠也常用于DVT模型的研究，其較小鼠的適應(yīng)能力、生存能力及抗感染能力更強(qiáng)，相比于其它中大型動物而言價格低，血栓完全形成的時間快，但大鼠與小鼠存在同樣的局限性。裸鼠也可用于DVT造模，裸鼠先天缺乏T細(xì)胞免疫，不干預(yù)異體組織和細(xì)胞，可以使用人類自身的細(xì)胞觀察血栓溶解、機(jī)化的過程，這是其他動物模型所不具備的，但裸鼠生存對環(huán)境要求嚴(yán)格，故臨床DVT造模時較少選用。 兔 兔子性格溫順，與大鼠對比，兔下腔靜脈較粗大，造模操作更容易，且血栓長度長，易于采集，血量更豐富，兩者都可形成穩(wěn)定的血栓，成功率高，也符合人體DVT急性期病理演變的特點，除價格較鼠類貴外無明顯差異；相比犬、豬等大型動物，購買成本及飼養(yǎng)成本低，給藥方便，利于實驗觀察。但兔子對感染的耐受力差，且由于生存周期長，老齡兔搜集困難。 其他動物 豬、犬和狒狒這類非人類的靈長類動物也可用于DVT造模，這類大型動物有與人類相似的靜脈解剖結(jié)構(gòu)，在血流動力學(xué)和血液學(xué)參數(shù)上具有其他動物不可比擬的優(yōu)勢，且靜脈粗、條件好、便于觀察，從而補(bǔ)充其他動物模型相關(guān)的不足，缺點則在于靜脈壁較薄、對操作者技術(shù)要求高、管理困難，死亡率高，且飼養(yǎng)條件和經(jīng)濟(jì)成本等也較其他動物高，此外，并不是所有的大型實驗動物模型都具有與人類的相似性和關(guān)聯(lián)性。 造模方法 下腔靜脈結(jié)扎法 下腔靜脈結(jié)扎法原理為：通過手術(shù)對實驗動物下腔靜脈阻塞造成： （1）局部血管損傷，暴露血管內(nèi)皮下組織因子； （2）局部造成低氧環(huán)境和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞變性，細(xì)胞漿內(nèi)大量空泡形成，細(xì)胞水腫呈球形等因素； （3）損傷后炎癥細(xì)胞浸潤及各種細(xì)胞因子釋放。 操作方法：實驗動物麻醉后，沿腹白線切開進(jìn)入腹腔，將小腸用一塊濕紗布包裹保護(hù)后推置于動物右側(cè)腹腔，顯露下腔靜脈及其主要屬支，于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈，后還納腸管并關(guān)閉腹腔。 評價：此法在研究溶栓和觀察血栓的動態(tài)過程中并不適用，且與人體DVT疾病的形成和演變不相符。 下腔靜脈狹窄法 通過外力加壓下腔靜脈致血流減少，導(dǎo)致層狀血栓形成，在保證血栓形成穩(wěn)定性的同時，保持近心端通暢。 操作方法：實驗動物麻醉后，取腹部正中切口并將小腸牽至腹外，不結(jié)扎周圍分支。用外科神經(jīng)血管鉗在15 s內(nèi)鉗夾腎靜脈以下的下腔靜脈2次，再用1根5-0縫線縱向置于下腔靜脈腹面，另1根4-0絲線繞在下腔靜脈和縫線周圍，之后移除縫線，讓血液流過。另外一種改進(jìn)法是：沒有外力加壓，但結(jié)扎側(cè)分支，保持后側(cè)分支開放，將 1 根 30 號的針頭與下腔靜脈用 7-0縫線一并綁繞，再移除針頭造成血管大約90%的狹窄。 評價：該方法成栓原因為血管縮窄和內(nèi)皮損傷，且移除針管后血管部分再通，所以，該方法被認(rèn)為適用于研究深靜脈血栓啟動機(jī)制研究和動態(tài)分析溶栓藥物機(jī)制。 電解下腔靜脈法 電解法的原理是直流電作用于血管，刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)。 操作方法：首先麻醉動物并顯露下腔靜脈及其屬支，結(jié)扎下腔靜脈周圍部分屬支。分別用1個針頭，連接到1個鍍銀的銅線并插入皮下組織（陰極）和尾部的下腔靜脈（陽極），施加 250 μA 的直流電 15 min，引起內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生反應(yīng)形成血栓錨，并認(rèn)為造模 2 d 后是急性 DVT，14 d 后是慢性 DVT。 評價：此法建模過程中血管溫度穩(wěn)定，血流影響小，類似于臨床上的深靜脈血栓形成條件，對局部組織刺激較小，適合研究血栓形成位置局部的細(xì)胞因子等變化。 促凝物質(zhì)干預(yù)法 促凝物質(zhì)干預(yù)法就是通過增加局部血液中促凝因子，促進(jìn)血栓形成。 操作方法有：局部注射促凝劑或糖皮質(zhì)激素等藥物，導(dǎo)致實驗動物血液高凝狀態(tài)而產(chǎn)生 DVT。此法能夠減輕手術(shù)刺激模擬非手術(shù)、創(chuàng)傷等條件下出現(xiàn)深靜脈血栓。 實驗方法：肌注 3% 戊巴比妥鈉麻醉成功后將犬仰臥固定在操作臺上，任選一側(cè)股靜脈區(qū)備皮，消毒、鋪單，結(jié)扎股靜脈的近、遠(yuǎn)端，并向腔內(nèi)注入生理鹽水5 mL稀釋的凝血酶100 U。經(jīng)彩色超聲證實深靜脈血栓的形成，并通過超聲彈性成像能有效地反映不同時期血栓的彈性硬度，可以根據(jù)血栓的彈性硬度來初步判斷血栓形成及分期。 評價：該模型可以模擬臨床因長期使用糖皮質(zhì)激素及腫瘤等非外傷手術(shù)等因素造成的自發(fā)性深靜脈血栓。 機(jī)械損傷法 血管內(nèi)皮損傷和血管、肌肉、骨骼等組織聯(lián)合損傷都容易造成患者出現(xiàn)深靜脈血栓。目前研究手術(shù)和創(chuàng)傷造成的深靜脈血栓多用創(chuàng)傷模擬法進(jìn)行造模。 01 人工造成靜脈內(nèi)皮的損傷法 通過血管夾在靜脈壁外直接鉗夾造成對靜脈內(nèi)壁的損傷；或者用刮匙對靜脈內(nèi)壁造成損傷。有學(xué)者在阻斷下腔靜脈后，快速注入生理鹽水，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，恢復(fù)血流 25 min 后觀察到血栓形成；或用蚊式鉗在股靜脈不同位置分別鉗夾3 s，并用髖關(guān)節(jié)“人”字石膏固定的方法來制備 DVT 動物模型。 評價：該方法常用于研究深靜脈血栓和炎癥及炎癥因子之間的關(guān)系。 02 機(jī)械擊打裝置法 通過物理創(chuàng)傷可建立具有骨科臨床特點的創(chuàng)傷性肢體DVT動物模型。 操作方法：是用定量打擊裝置進(jìn)行擊打造成實驗動物骨折或損傷組織并固定模擬臨床上創(chuàng)傷—固定這一過程。具體方法是用一定能量擊打造成的骨折，行髖關(guān)節(jié)“人”字石膏固定，7 d 后用肉眼和光鏡觀察DVT形成。 評價：該方法造模成功率差異較大，但較為符合臨床實踐中創(chuàng)傷引起的深靜脈血栓形成原因。目前仍有大量學(xué)者使用該法進(jìn)行抗凝藥物機(jī)理研究和相關(guān)基因及信號傳導(dǎo)通路研究。 總結(jié) 目前建立深靜脈血栓模型，選擇實驗動物和建模方法眾多，各有利弊，在實驗設(shè)計時應(yīng)根據(jù)具體實驗?zāi)康暮蛯嶒炇覘l件進(jìn)行選擇。 造模方法評價：下腔靜脈結(jié)扎等方法成功率高，對血管影響大，并不能完全模擬臨床實踐中自然形成的深靜脈血栓；促凝藥物法可模擬高凝狀態(tài)形成血栓；機(jī)械打擊法最符合骨科創(chuàng)傷后血栓形成的臨床過程，但是目前造模成功概率不穩(wěn)定。 迄今為止，建模方式中大多數(shù)模型僅能體現(xiàn)血栓形成三大因素中的靜脈壁受損、靜脈血流滯緩兩因素，多無法體觀血液高凝狀態(tài)這一因素，這也是將來深靜脈血栓形成動物模型研究中需解決的問題，此外，大部分的造模方法都適宜于研究急性和慢性DVT，而對亞急性的模型研究較少。 因此，深入了解每一種動物模型的優(yōu)勢和缺陷，包括詳細(xì)的特征描述，對于特定的研究問題選擇合適的模型是十分必要的。直到目前為止大多數(shù)造模方法還未建立統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)，相信隨著醫(yī)療科學(xué)技術(shù)的發(fā)展會讓造模更加的簡單和科學(xué)，對造模過程細(xì)節(jié)的把握也將更好，我們需要根據(jù)不同的研究目的以及不同的發(fā)病機(jī)制，選用不同的造模方法。 |
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