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實驗技巧 | 一文了解細胞轉(zhuǎn)染
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細胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子（如DNA、RNA等）導入真核細胞的技術(shù)。目前，其已成為實驗室工作中最常涉及的基本方法，是研究基因表達調(diào)控、突變分析等的常規(guī)工具。 轉(zhuǎn)染方法大致可分為物理介導（如電穿孔法、顯微注射和基因槍等）、化學介導（脂質(zhì)體及其代替物、磷酸鈣等）和生物介導（各類病毒，包括腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒等）三類途徑。 細胞轉(zhuǎn)染又分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時轉(zhuǎn)染是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到細胞的染色體上，基因表達維持時間較短，通常在96h以內(nèi)；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指DNA整合到宿主細胞的染色體中，使宿主細胞可長期表達目的基因。 目前，大多采用依據(jù)不同質(zhì)粒載體含有的抗性標志選用相應(yīng)的抗生素對靶細胞進行篩選，常用的抗生素有嘌呤霉素（Puromycin）、G418（Geneticin）等。 1、主要有下面幾種 化學法：磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法； 物理法：電穿孔法、顯微注射法、biolistic顆粒傳遞法； 病毒介導法：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒 A. 陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞。 特點：簡單通用，適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清，轉(zhuǎn)染效率隨細胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。 B. 電穿孔法：利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾，使其形成利于核酸進入的微孔。 C. 逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA）：通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞，之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中。 特點：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞，體內(nèi)細胞等，但攜帶基因不能太大。 D. 腺病毒（雙鏈DNA）：先和細胞表面的受體結(jié)合，繼而在αV整合素介導下被細胞內(nèi)吞。 特點：可用于難轉(zhuǎn)染的細胞。 2、影響轉(zhuǎn)染的因素 血清：血清影響復合物的形成，降低轉(zhuǎn)染效率。 陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時要進行條件優(yōu)化。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。 抗生素：比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉(zhuǎn)染效率低。 細胞代數(shù)：轉(zhuǎn)染前細胞最好經(jīng)過1-2次傳代保證細胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染，注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉(zhuǎn)染。 細胞鋪板密度：一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2*10^6--4*10^6 細胞/ml 時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。 DNA質(zhì)量：DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進行。 |
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