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百事可愛66新蟲 (小有名氣)
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[交流]
抗體保存好，實(shí)驗(yàn)失敗少
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一、保存溫度和條件 很多抗體的最佳保存條件是分裝成小包裝凍存于-20°C或-80°C。分裝能使凍融引起的損失減到最小，同時(shí)可避免多次在一個(gè)管內(nèi)取樣而由槍頭引入的污染。分裝凍存的抗體，融解一次后剩余抗體應(yīng)保存于4°C。收到抗體后，應(yīng)10,000 x g 離心20秒，使管口螺紋內(nèi)的抗體溶液全部離心至管底，用低蛋白吸附性的微量離心管分裝。分裝量的多少取決于每次試驗(yàn)的使用量。分裝量不能少于10μl；分裝量越少，由于蒸發(fā)和吸附于管內(nèi)壁而引起的損失會(huì)越大。 除了腹水液含蛋白酶應(yīng)立即凍存外，大多數(shù)抗體接收后可在4°C保存一至兩周，隨后可凍存以長(zhǎng)期保存。同樣，應(yīng)按照說明書推薦的條件進(jìn)行保存。 二、特殊情況 1、酶聯(lián)抗體，不應(yīng)凍存，4°C可保證穩(wěn)定。凍融會(huì)降低酶的活性，同時(shí)影響抗體的吸附能力。 2、偶聯(lián)標(biāo)記的抗體，無論是標(biāo)記的熒光染料、酶還是生物素，都應(yīng)保存于深色的管內(nèi)并包裹上鋁箔。如果暴露在光線下可能會(huì)減弱偶聯(lián)標(biāo)記物的活性。熒光標(biāo)記物尤其容易受到光漂白作用，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均應(yīng)避光。 3、免疫球蛋白G3同種型抗體凍融后易形成聚合物，因此應(yīng)一直保存于4°C。 4、用疊氮化鈉防止污染 為防止微生物污染，在抗體溶液中應(yīng)加入疊氮化鈉，終濃度為0.02%（質(zhì)量百分比）。 5、什么時(shí)候不能用疊氮化鈉 如果用抗體標(biāo)記活細(xì)胞，或用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，確保所用制劑中不含疊氮化鈉。這種抗生素對(duì)大多數(shù)有機(jī)體都有毒性：會(huì)阻斷細(xì)胞色素電子傳遞系統(tǒng)的信號(hào)。 疊氮化鈉會(huì)干擾胺基的偶聯(lián)標(biāo)記，應(yīng)在進(jìn)行標(biāo)記之前將其除去。標(biāo)記后抗體可保存于疊氮化鈉，也可用不含胺基的硫柳汞替代。疊氮化鈉可用透析或凝膠過濾法從抗體溶液中除去。免疫球蛋白 G的分子量是150,000 kDa（免疫球蛋白M的分子量是600,000 kDa），疊氮化鈉的分子量是65道爾頓。使用14,000 kDa的微量透析裝置，隨著疊氮化鈉的擴(kuò)散，抗體將保留。將帶有燒杯的磁力攪拌器置于4°C攪拌透析裝置6小時(shí) , 每毫升抗體溶液要用至少1升的磷酸鹽緩沖液。更換2次磷酸鹽緩沖液，每次均攪拌至少6小時(shí)。如果可以的話，所有材料均要求無菌，所有溶液都應(yīng)無菌配制。 三、凍存 / 復(fù)蘇的損失 反復(fù)凍融可使抗體變性，使其形成聚合物而降低了抗體結(jié)合能力。 大多數(shù)抗體在-20°C保存就足夠了，沒有必要置于-80°C保存。千萬不要使用無霜的冰箱。反復(fù)凍融能減少霜的形成，但這正是應(yīng)該避免的。同理，抗體應(yīng)該放置于冰箱中溫度變化最小的部位，如應(yīng)放置于冰箱格里，而不應(yīng)放置于冰箱門上。 稀釋至工作濃度的抗體最好不要在4°C保存超過一天時(shí)間。通常蛋白質(zhì)在較高濃度保存時(shí)不易發(fā)生降解，理想濃度為1mg/ml或更高，因?yàn)榭贵w溶液中包含了如牛血清白蛋白等蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。加入的蛋白可吸附于管壁從而使抗體的損失減到最小。對(duì)用于聚合的抗體，不應(yīng)加入蛋白穩(wěn)定劑，因?yàn)槠淇赡軙?huì)與抗體競(jìng)爭(zhēng)而降低抗體的聚合活性。 |
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