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[求助]
Aβ纖維的培養(yǎng)
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本人近期用Aβ建立AD體外模型，搜了很多的文獻(xiàn)，總結(jié)之后，分別進(jìn)行了如下嘗試： 1.Aβ單體粉末以1mg/mL的濃度溶于HFIP中，室溫分別靜置1h/2h/24h或4℃分別靜置1h/2h/24h（期間也有過(guò)超聲）； 2.通風(fēng)櫥放置整夜或N2流吹干成膜，然后直接進(jìn)行下一步或者冷凍干燥整夜； 3.分別不用助溶劑、2%DMSO、20毫摩爾的NaOH 溶解Aβ膜，然后分別用1XPBS（PH7.4）、HEPES緩沖液（PH7.4）、Tris-HCl（PH7.4）、生理鹽水、雙蒸水稀釋至Aβ為20μM； 4.搖床37℃放置2天至7天。 2天后，所培養(yǎng)的Aβ有的有明顯的纖維狀沉淀物析出，有的很澄清。 問(wèn)題是，在此期間用ThT染料測(cè)熒光基本都有明顯變化，TEM也顯示出明顯的纖維狀結(jié)構(gòu)，但是CD顯示無(wú)序結(jié)構(gòu)或者不是典型的β-sheet結(jié)構(gòu)，按一定濃度擴(kuò)大培養(yǎng)之后進(jìn)行PC12細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)（Aβ最終濃度為10μM或20μM，測(cè)試為CCK-8）,基本都沒(méi)有毒性。Aβ42前后買(mǎi)了兩家公司的，DMSO也換過(guò)超干和不同品牌的，各種緩沖液自行配制過(guò)，也買(mǎi)過(guò)現(xiàn)成的。 請(qǐng)問(wèn)有沒(méi)有大佬能看出其中細(xì)節(jié)的不足或者能否分享一下成功的方法，可有償，非常感謝�。。� |
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