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原核蛋白表達的整體實驗流程和具體實驗結(jié)果
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一、假設(shè)目標蛋白的信息 名稱： XXX蛋白 大�。� 30 kDa 緩沖液：PBS 濃度： 0.6mg/mL 體積： 6mL （3管分裝） 標簽: 僅6Xhis 純度： 90%以上 二、實驗過程 1蛋白表達載體的構(gòu)建 1.1 序列二基因序列密碼子優(yōu)化后合成及構(gòu)建 Optimized for your reference: CATATGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCTCGAG 合成時候帶上上下游酶切位點分別是Nde I，Xho I（黃色陰影），并克隆到原核表達載體Pet24a載體。 1.2 DNA測序 將經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性克隆測序，測序工作由華大基因完成（見附件）。 2 構(gòu)建正確的Pet24a-序列二表達載體在大腸桿菌中的表達 2.1 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) 常規(guī)CaCl2法。 2.2 IPTG誘導融合蛋白的表達 2.2.1 挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50 μg/ml Kan的3 ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃ 220 rpm振搖過夜； 2.2.2 次日按1：100接種于50 μg/ml Kan的30 ml LB培養(yǎng)液中，37℃ 220 rpm振搖至菌體OD600為0.4 (約2h)； 2.2.3 取出1 ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀； 2.2.4 向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/l，37℃ 220 rpm振搖4 h，誘導序列二蛋白表達； 2.2.5取出1 ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，剩余培養(yǎng)物4℃ 4000g離心12 min，棄上清，沉淀置-20℃凍存。 2.3 表達產(chǎn)物分布的確定 2.3.1 將表達菌體重懸于400 μl Ni-IDA Binding-Buffer(20 mM Tris-HCl，5 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)； 2.3.2 重懸液進行超聲波破碎(冰浴中進行)：功率100 W，工作4 sec，間歇8 sec，共10 min； 2.3.3 超聲破碎液4℃ 12000g離心20 min，取10 μl上清液加入等量的2×上樣緩沖液，沉淀用400 μl 1×上樣緩沖液重懸后取5 μl，恒壓150 V進行12% SDS-PAGE，考馬斯亮藍R250染色顯帶。 3融合蛋白的純化 3.1 將1 L誘導表達的培養(yǎng)菌體沉淀用20 ml Ni-IDA Binding-Buffer重懸后，超聲破碎(功率200 W，工作4 sec，間歇8 sec，共20 min)，4℃ 12000g離心20 min，取上清； 3.2 利用Biologic LP層析系統(tǒng)，上清液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱； 3.3 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線； 3.4 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，30 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線； 3.5 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液； 3.6 進行12% SDS-PAGE分析。 三、實驗結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)合考染鑒定純化的XXX蛋白 1-4泳道分別指XXX蛋白放大表達后的全菌、破碎上清、純化時20mM咪唑洗脫液以及250mM咪唑洗脫液。 |
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