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科研小努力新蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
蛋白純化的步驟
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1、構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒：目的基因PCR，載體酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑單克隆送測(cè)序； 2、將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑單克隆小搖過(guò)夜； 3、小誘導(dǎo)摸索最佳誘導(dǎo)條件：將搖過(guò)夜的菌液1:1000接種到3mL LB中，37℃搖4-5h至菌液OD600=0.6-0.8，加入不同濃度IPTG（0.1-1mM），不同溫度下誘導(dǎo)，隨著溫度降低，誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，如37 ℃ 誘導(dǎo)4-5h，30°C誘導(dǎo)6h-8h，16°C誘導(dǎo)16-20h，取不同誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液，跑膠，考染，觀察誘導(dǎo)結(jié)果；（一般來(lái)說(shuō)，IPTG濃度越低，誘導(dǎo)溫度越低，目的蛋白表達(dá)越慢，越利于蛋白質(zhì)的正確折疊從而增加其可溶性，減少包涵體的產(chǎn)生）； 4、找到最適誘導(dǎo)條件后，將菌液1:1000接種到2L的LB中，37℃搖至菌液OD600=0.6-0.8，吸出20μL菌液留待跑膠(1)，然后在預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的合適的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，吸出20μL菌液留待跑膠(2)； 5、取出誘導(dǎo)后的菌液，4000g，4℃離心15min； 6、棄上清液，稱重，每克菌加入10mL Lysis buffer（1:100加蛋白酶抑制劑），重懸，冰上放置約30min； 7、壓力破碎：放掉高壓均質(zhì)儀中的酒精，用水沖兩遍，用Lysis buffer平衡一遍，加入菌液，加壓（壓力不要超過(guò)800kpa），菌液過(guò)三到五遍至透明不粘稠； 8、收集破碎后的菌液，12000g，4℃離心20min，將上清和沉淀分離，各留取20μL樣品(3)(4)待跑膠； 9、將2mL Ni-NTA加入純化柱，待乙醇濾過(guò)，用水沖洗，加入Lysis buffer平衡柱子； 10、用Lysis buffer將Ni-NTA重懸加入上清中，混勻，4℃搖床孵育2h； 11、將上清液4℃過(guò)柱，收集濾過(guò)液20μL(5)； 12、用5mL Wash buffer洗柱子3次，收集濾過(guò)液樣品20μL(6)； 13、加入1mL Elution buffer，孵育5min，收集洗脫液，重復(fù)5次，收集5mL洗脫液于同一管中，留取20μL樣品(7)； 14、將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到的各個(gè)蛋白樣品跑膠，考馬斯亮藍(lán)染色1h，脫色至背景藍(lán)色較淺，可見(jiàn)清晰蛋白條帶； 15、分析各個(gè)樣品的蛋白條帶情況，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)操作：若洗脫蛋白樣品中蛋白無(wú)雜帶或雜帶少且淺，可進(jìn)行透析與濃縮，若雜帶多則需要再次純化后進(jìn)行透析與濃縮。 16、透析：將樣品加入透析膜中，兩端夾緊，4℃透析過(guò)夜； 17、濃縮：根據(jù)樣品分子量大小選擇合適的濃縮管4℃低速濃縮，濃縮后測(cè)蛋白濃度，分裝標(biāo)記，在液氮中速凍，然后凍存于-80℃冰箱。 |
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