 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 772 | 回復(fù): 1 | |||
科研小努力新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
原核蛋白表達(dá)的整體實(shí)驗(yàn)流程和具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 已有1人參與
|
|
一、假設(shè)目標(biāo)蛋白的信息 名稱： XXX蛋白 大小： 30 kDa 緩沖液：PBS 濃度： 0.6mg/mL 體積： 6mL （3管分裝） 標(biāo)簽: 僅6Xhis 純度： 90%以上 二、實(shí)驗(yàn)過程 1蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 1.1 序列二基因序列密碼子優(yōu)化后合成及構(gòu)建 Optimized for your reference: CATATGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCTCGAG 合成時候帶上上下游酶切位點(diǎn)分別是Nde I，Xho I（黃色陰影），并克隆到原核表達(dá)載體Pet24a載體。 1.2 DNA測序 將經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性克隆測序，測序工作由華大基因完成（見附件）。 2 構(gòu)建正確的Pet24a-序列二表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá) 2.1 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) 常規(guī)CaCl2法。 2.2 IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá) 2.2.1 挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種于含50 μg/ml Kan的3 ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃ 220 rpm振搖過夜； 2.2.2 次日按1：100接種于50 μg/ml Kan的30 ml LB培養(yǎng)液中，37℃ 220 rpm振搖至菌體OD600為0.4 (約2h)； 2.2.3 取出1 ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀； 2.2.4 向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/l，37℃ 220 rpm振搖4 h，誘導(dǎo)序列二蛋白表達(dá)； 2.2.5取出1 ml培養(yǎng)物，12000g室溫離心2 min，棄上清，用100 μl 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀，剩余培養(yǎng)物4℃ 4000g離心12 min，棄上清，沉淀置-20℃凍存。 2.3 表達(dá)產(chǎn)物分布的確定 2.3.1 將表達(dá)菌體重懸于400 μl Ni-IDA Binding-Buffer(20 mM Tris-HCl，5 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)； 2.3.2 重懸液進(jìn)行超聲波破碎(冰浴中進(jìn)行)：功率100 W，工作4 sec，間歇8 sec，共10 min； 2.3.3 超聲破碎液4℃ 12000g離心20 min，取10 μl上清液加入等量的2×上樣緩沖液，沉淀用400 μl 1×上樣緩沖液重懸后取5 μl，恒壓150 V進(jìn)行12% SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R250染色顯帶。 3融合蛋白的純化 3.1 將1 L誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)菌體沉淀用20 ml Ni-IDA Binding-Buffer重懸后，超聲破碎(功率200 W，工作4 sec，間歇8 sec，共20 min)，4℃ 12000g離心20 min，取上清； 3.2 利用Biologic LP層析系統(tǒng)，上清液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱； 3.3 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達(dá)基線； 3.4 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，30 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達(dá)基線； 3.5 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液； 3.6 進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)合考染鑒定純化的XXX蛋白 1-4泳道分別指XXX蛋白放大表達(dá)后的全菌、破碎上清、純化時20mM咪唑洗脫液以及250mM咪唑洗脫液。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
085600 材料與化工 298
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
266求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
0854總分272
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
EST拒稿重投
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
歡迎采礦、地質(zhì)、巖土、計(jì)算機(jī)、人工智能等專業(yè)的同學(xué)報考
已經(jīng)有11人回復(fù)
-
0703化學(xué)學(xué)碩 288分
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
接收調(diào)劑
已經(jīng)有23人回復(fù)
-
化學(xué) 0703求調(diào)劑 總分293 一志愿211
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
304分材料專碩求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
0703化學(xué) 學(xué)碩 理工科均可 不區(qū)分研究方向 總分279求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
劉俊華
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 15.6
- 散金: 1
- 帖子: 29
- 在線: 7.1小時
- 蟲號: 33596324
- 注冊: 2023-04-12
- 性別: GG
- 專業(yè): 免疫生物學(xué)
2樓2023-09-20 17:42:35
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研小努力 的主題更新
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[論文投稿]
EST拒稿重投
 5+3
|
15102603076 2026-03-02 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 學(xué)碩材料275調(diào)劑 +4 | 路三三 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿中海洋 +3 | lour. 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請] 請問大家，研究風(fēng)險與應(yīng)對措施那里， 大家都怎么寫呢 ？ +3 | cauasen 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 298 調(diào)劑 +3 | 小西笑嘻嘻 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0805總分292，求調(diào)劑 +12 | 幻想之殤 2026-03-01 | 12/600 |
|
|
|
[考博] 26申博 +4 | north， 2026-02-28 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +4 | wxz2 2026-03-03 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 考研復(fù)試調(diào)劑，過國家線的同學(xué)都可報名 +7 | 黑！在干嘛 2026-02-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑材料學(xué)碩 +4 | 詞凝Y 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化工京區(qū)271求調(diào)劑 +7 | 11ing 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料085601調(diào)劑 +5 | 多多子. 2026-03-02 | 5/250 |
|
|
|
[考博] 誠招農(nóng)業(yè)博士 +3 | 心欣向榮 2026-02-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 291 求調(diào)劑 +3 | 化工2026屆畢業(yè)?/a> 2026-03-02 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 284求調(diào)劑 +10 | 天下熯 2026-02-28 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 一志愿鄭大材料學(xué)碩298分，求調(diào)劑 +6 | wsl111 2026-03-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑 +3 | 13853210211 2026-03-02 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料類求調(diào)劑 +11 | wana_kiko 2026-02-28 | 14/700 |
|
|
|
[碩博家園] 博士自薦 +7 | 科研狗111 2026-02-26 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 272求調(diào)劑 +6 | 田智友 2026-02-28 | 6/300 |
|