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液相色譜柱柱壓升高原因及解決辦法
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作為液相色譜系統(tǒng)的核心耗材，液相色譜的色譜柱可以說是整個(gè)液相色譜系統(tǒng)的核心了。它不僅決定了液相色譜系統(tǒng)是否能夠正常運(yùn)轉(zhuǎn)，也極大的影響了液相色譜體統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)然，作為一種耗材，液相色譜柱最終還是會(huì)損壞并報(bào)廢的，液相色譜柱的損壞70-80%都是由于柱壓升高導(dǎo)致的，色譜柱使用了一段時(shí)間以后，壓力會(huì)有所升高，達(dá)到一定程度以后色譜柱就會(huì)報(bào)廢。但是如果在一天之內(nèi)壓力升高了2-5個(gè)mpa，或者在幾次使用后壓力就翻倍的升高，這些都是異常狀況，那建議進(jìn)行排除。那么液相色譜柱柱壓升高的原因有哪些？ 色譜柱保存不當(dāng) 色譜柱保存不當(dāng)是較為常見的液相色譜柱柱壓升高的原因，主要有一下兩個(gè)方面： （1）色譜柱如較長(zhǎng)時(shí)間不用，重新啟用后需按說明書的活化方法重新活化后再使用，否則也會(huì)出現(xiàn)柱壓升高，柱效下降。 解決辦法：按說明書重新活化色譜柱。 （2）除另有規(guī)定外，一般反相色譜柱都需保存在高比例有機(jī)相中，以防止微生物滋生。否則，重新啟用時(shí)，會(huì)因微生物滋生而導(dǎo)致柱壓異常升高。 解決辦法：這種情況，可以嘗試用乙腈-水-TFA=50-50-0.1低流速過夜沖洗色譜柱。 樣品污染 樣品污染也是較為常見的液相色譜柱柱壓升高的原因。因?yàn)榇龣z測(cè)樣品成分復(fù)雜，部分成分死吸附在柱頭端，導(dǎo)致柱壓升高，柱效下降。 辦法1：中藥項(xiàng)目往往樣品會(huì)比較臟，使用一定時(shí)間后，會(huì)因柱頭污染導(dǎo)致色譜柱性能下降，這種情況下，可將色譜柱反接并按說明書的異常沖洗方法進(jìn)行沖洗。 辦法2：加保護(hù)柱，保護(hù)柱為一種犧牲式攔截污染，有一定的使用壽命。做的過程中關(guān)注柱壓，如柱壓升高10%，則需更換保護(hù)柱芯。有些柱溫箱無法放入保護(hù)柱，則可償試將保護(hù)柱接在柱前，進(jìn)樣品后，但這種情況需對(duì)比不加保護(hù)柱的分析圖譜，確定沒有因保護(hù)柱與檢測(cè)色譜柱的柱溫差異而產(chǎn)生色譜圖差異的情況下，才可以使用。 辦法3：檢測(cè)樣品建議采用小孔徑的濾頭或?yàn)V膜(如0.22μm)進(jìn)行過濾后再進(jìn)樣，以盡量減少污染物進(jìn)入色譜柱。 辦法4：定期維護(hù)色譜柱(確認(rèn)為樣品污染導(dǎo)致柱效下降，而不是填料塌陷的)：對(duì)于確認(rèn)是樣品污染導(dǎo)致色譜柱使用一段時(shí)間柱效下降的，建議對(duì)該項(xiàng)目使用的色譜柱反接后按說明書的異常再生方法進(jìn)行定期維護(hù)；這種處理的好處是，能減少柱子污染物聚集，延長(zhǎng)色譜柱使用壽命。 其他相關(guān)知識(shí)點(diǎn)： 柱壓反映了色譜柱的內(nèi)部狀況，所以是 HPLC方法中的最重要參數(shù)之一，當(dāng)柱壓升高接近上限或者柱壓有異常升高，往往意味著色譜柱出狀況了，需及時(shí)進(jìn)行維護(hù)和補(bǔ)救，嚴(yán)重時(shí)色譜柱就已報(bào)廢了。下面是色譜柱柱壓方程。 對(duì)填充色譜柱，柱壓與黏度 (η)、柱長(zhǎng) (L)和流速 (F)成正比，與填料粒徑（d p）以及柱管半徑（r）的平方成反比。K0是比滲透性系數(shù)，對(duì)填充床，其值約為0.001。通過此公式可近似計(jì)算出給定色譜條件下的理論柱壓。只有當(dāng)新柱實(shí)際測(cè)得的柱壓和理論柱壓相差很大，才能說柱壓存在問題。 黏度 (η)取決于流動(dòng)相溶劑的選擇，為降低柱壓，反相色譜中傾向于選擇低黏度的乙腈，而不是高黏度的異丙醇。當(dāng)然選擇時(shí)還需考慮溶劑強(qiáng)度、極性、分析物的溶解度以及和分析物兼容性等。柱長(zhǎng)（L）增加可以提高分離度（R），流速（F）提高能加快分離，但都會(huì)導(dǎo)致柱壓上升，選擇確定這些運(yùn)行參數(shù)時(shí)，需綜合平衡和折中。 填料粒徑對(duì)柱壓影響極大，d p降低一倍，柱壓將增加4倍。UHPLC中采用的sub-2 μm填料，柱壓超過普通HPLC泵的400Bar上限很多。提高柱溫因可降低黏度η，相應(yīng)降低柱壓。在梯度洗脫時(shí)，黏度隨流動(dòng)相組成的變化而改變，柱壓也會(huì)處在不斷變化中。對(duì)水/甲醇流動(dòng)相體系，在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值 內(nèi)徑的影響同樣很大，根據(jù)線流速相同柱壓相同的原則，4.6mm內(nèi)徑的色譜柱流速為1mL/min，約相當(dāng)于在2.1mm內(nèi)徑色譜柱上的0.2mL/min流速，在10mm半制備色譜柱上的5mL/min，計(jì)算公式為v＝1.0mL/min x（內(nèi)徑r/4.6）2。所以在換不同內(nèi)徑色譜柱時(shí)，請(qǐng)及時(shí)調(diào)整流速，以免因高柱壓損傷色譜系統(tǒng)。 柱壓下降是儀器系統(tǒng)的連接有泄漏，柱壓不穩(wěn)定一般認(rèn)為是流路中有氣泡或空穴，和色譜柱相關(guān)的柱壓?jiǎn)栴}是柱壓上升。 柱壓波動(dòng)的原因及解決辦法 和柱壓波動(dòng)相關(guān)最大的是進(jìn)口端篩板（inlet frit）以及其后面1-2cm長(zhǎng)度的柱頭填料。篩板上有比填料粒徑小的小孔，篩板上的小孔或柱頭填料的間隙被部分堵塞，是柱壓上升的主要原因。有以下幾類情況： 1、填料破碎和使用后有填料粉末生成 填料破碎一般在裝柱過程中發(fā)生，裝柱壓力過大或所選硅膠機(jī)械強(qiáng)度過低所至，設(shè)定柱壓出廠標(biāo)準(zhǔn)可解決；流動(dòng)相中高pH值緩沖鹽使硅膠溶解并重新形成填料粉末，堵塞出口端篩板，這種情況下反沖不起作用，只有更換后篩板，不過打開承壓的后篩板，對(duì)柱床會(huì)有不好影響。 2、顆粒物堵塞引起柱壓上升和對(duì)策 可能堵塞進(jìn)口端篩板（前篩板）和柱頭填料間隙的顆粒物來源有：樣品（制樣時(shí)灰塵和濾紙等帶入）、進(jìn)樣閥密封圈磨損、流動(dòng)相（溶劑本身含有和配制過程進(jìn)入）、液相儀器中泵閥密封圈的磨損、緩沖鹽析出（一般在梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變導(dǎo)致）。 水和緩沖鹽流動(dòng)相內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌，也是顆粒物來源的一種，可堵塞篩板和填料間隙。應(yīng)避免將這類流動(dòng)相在室溫下久放，可放入冰箱存放。 （1）預(yù)防措施 樣品（甚至標(biāo)準(zhǔn)品）和流動(dòng)相過濾，既預(yù)防了篩板、柱頭和毛細(xì)管堵塞，又能減少進(jìn)樣閥、活塞桿和截止閥等儀器關(guān)鍵部件的磨損。普通用0.45μm孔徑濾膜過濾樣品和流動(dòng)相，對(duì)使用2μm以下填料的超高壓柱的，可用0.20μm濾膜。濾膜材質(zhì)有再生纖維素、聚四氟乙烯、尼龍、硝酸纖維和醋酸纖維等，須根據(jù)和樣品溶劑及分析物的適應(yīng)性慎重選擇。 使用保護(hù)柱或在線過濾器，具體安裝位置見下圖： 在線過濾器內(nèi)裝有可更換的濾片，濾片孔徑一般有2μm和0.5μm兩種。安裝位置有兩個(gè)可選擇，在進(jìn)樣器和色譜柱之間時(shí)，對(duì)樣品和流動(dòng)相中的顆粒物都有效；在泵和進(jìn)樣器之間，則只對(duì)流動(dòng)相有過濾作用。 保護(hù)柱是縮小版的色譜柱，內(nèi)含帶填料的可更換的柱芯，安裝在進(jìn)樣閥和色譜柱之間，用于防止色譜柱的化學(xué)污染為主，也有過濾顆粒物的作用。 （2）故障排除 反沖色譜柱：不連接檢測(cè)器，直接將堵在前篩板上的顆粒物沖出排到廢液瓶中。開始時(shí)反沖壓力可低于正常使用壓力，待顆粒物有沖出后，逐步提高沖洗壓力。有時(shí)顆粒物已非常牢固嵌入到篩板內(nèi)部，反沖不一定湊效，早反沖、勤反沖相對(duì)效果更好。有的廠商為避免堵塞，使用了較大孔徑（2-5μm）的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出。 換篩板：一般不建議這樣做，因?yàn)閾Q篩板會(huì)帶走粘在篩板上的部分填料，使柱床的均一性受影響，導(dǎo)致柱效下降。不過如果反沖不能解決問題，也只能不得已而為之，要不然就要把色譜柱報(bào)廢了。 如果系統(tǒng)中不接色譜柱，柱壓仍然高，說明泵出口到色譜柱之間的其它部位，包括進(jìn)樣器、在線過濾器和保護(hù)柱等有堵塞，可逐一排查。為了減少死體積，毛細(xì)管都做得盡可能的細(xì)，也可能被堵 3、化學(xué)污染物引起柱壓上升和對(duì)策 來源同樣是樣品、流動(dòng)相和系統(tǒng)，不過來源于樣品的污染最普遍，特別是對(duì)復(fù)雜基體樣品未經(jīng)前處理或前處理不夠的時(shí)候�；瘜W(xué)污染物主要有：分子量很大的化合物、鹽類、脂質(zhì)、蠟類、油脂、腐殖酸、蛋白質(zhì)等其它生物來源的物質(zhì)。 像鹽類這樣的保留能力極小的污染物會(huì)在死體積處很快從柱中洗脫出去，檢測(cè)器一般對(duì)此類物質(zhì)響應(yīng)不大，有時(shí)表現(xiàn)為干擾峰、基線波動(dòng)、斑點(diǎn)甚至負(fù)峰。 保留能力中等的污染物，會(huì)被慢慢洗出色譜柱，表現(xiàn)為寬峰、基線饅頭形波動(dòng)和基線緩慢漂移。 對(duì)強(qiáng)保留的污染物，一般流動(dòng)相強(qiáng)度不足以將其從柱中洗出，會(huì)逐步在柱頭累積。有時(shí)，累積在柱頭的污染物可作為新固定相對(duì)分析物起作用，引起保留時(shí)間改變、峰拖尾和峰分叉等。污染物在柱頭累積到一定程度，如果不采取措施，會(huì)堵塞填料間隙，引起柱壓上升。最好的辦法是選用合適的溶劑沖洗溶解這些物質(zhì)，同時(shí)又不對(duì)填料本身有損害。如聚合物柱中累積的蛋白類污染物可用pH13-14的強(qiáng)堿溶液洗掉，但這種方法不適合硅膠基質(zhì)色譜柱。 （1）預(yù)防措施： a．制樣時(shí)采用SPE固相萃取等方法，預(yù)先將色譜柱殺手類的污染物質(zhì)清除掉； b．連接保護(hù)柱。保護(hù)柱是分析柱的延伸，在填料類型和粒徑上應(yīng)與分析柱一致，才能最大限度起保護(hù)作用，又不影響色譜性能。一個(gè)設(shè)計(jì)和裝填良好的保護(hù)柱，還可增加分析柱的分離效率。如果因某種原因需在保護(hù)柱中用不同的填料，也應(yīng)選擇比其所保護(hù)的分析柱保留能力弱的固定相，這時(shí)的保護(hù)柱完全用于截住強(qiáng)保留物質(zhì)，類似于SPE小柱的功效。當(dāng)保護(hù)柱柱芯保護(hù)功能用盡時(shí)，也不能說不可再清洗后復(fù)用，但價(jià)格低不值得去花這個(gè)時(shí)間。 c．經(jīng)常對(duì)分析柱進(jìn)行沖洗維護(hù)。 （2）故障排除： 已經(jīng)累積很多污染物，用甲醇或乙腈簡(jiǎn)單沖洗不奏效，推薦使用下面方法清洗反相柱100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％異丙醇---100％異丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷用每種溶劑沖洗至少10個(gè)柱體積，對(duì)于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2mL/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動(dòng)相體系。 對(duì)受蛋白類污染的硅膠基質(zhì)反相柱，純有機(jī)溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質(zhì)。由有機(jī)溶劑、緩沖液和酸,有時(shí)還加上離子對(duì)試劑等組成的配方清洗效果極佳，譬如用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液對(duì)柱子重復(fù)進(jìn)行梯度洗來再生；Bhadwaj和Day試驗(yàn)了在250mm×4.6mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇，再生效果良好。 清洗硅膠、CN和Diol等正相柱建議方法：先用20柱體積50：50正己烷/氯仿沖洗，然后用甲醇、二氯甲烷或者100%醋酸乙酯沖洗。對(duì)油脂類物質(zhì)，可用異丙醇清洗。 |
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簡(jiǎn)單回復(fù)
2023-07-24 12:22
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專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
tzynew3樓
2023-07-24 23:21
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專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
2023-07-25 18:39
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專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
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