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28968058wj新蟲 (小有名氣)
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提取高質(zhì)量的RNA！RNA提取實(shí)驗(yàn)操作步驟
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什么是RNA提取 細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白,DNA等雜質(zhì),最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過程。 RNA提取的使用目的 通過總RNA提取可獲得高純度及高質(zhì)量的總RNA,可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Northern blot、microRNA檢測(cè)、芯片分析, DNA文庫構(gòu)建,基因克隆等實(shí)驗(yàn)。RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn),其質(zhì)量要求不盡相同。 cDNA文庫構(gòu)建要求RNA完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留; Northern對(duì)RNA完整性要求較高,對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低; RT-PCR對(duì)RNA完整性要求不太高,但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此,明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖沁M(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的首要條件。 RNA提取的方法 RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在勻質(zhì)化或溶解樣品中,Trizol試劑可保持RNA的完整性,同時(shí)能破壞細(xì)胞及溶解細(xì)胞成分。加入氯仿離心后,裂解液分層成水相和有機(jī)相。RNA存在于水相中。 水相轉(zhuǎn)移后,RNA通過異丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可從中間相沉淀得到DNA,加入異丙醇沉淀可從有機(jī)相得到蛋白質(zhì)。 RNA提取實(shí)驗(yàn)操作步驟 準(zhǔn)備試劑: 氯仿,異丙醇,75℅乙醇,無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)。 操作步驟: 1.勻漿處理 a)植物組織: 以葉片RNA提取為例.取新鮮葉片在液氮中充分研磨或?qū)⑷~片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超過1min.,大約100mg 葉片使用1 ml Trizol. b)動(dòng)物組織: 以鼠肝臟RNA提取為例.取新鮮或-70℃凍存組織,每50-100mg組織加1ml Trizol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理.樣品體積一般不要超過Trizol體積的10%. c)單層培養(yǎng)細(xì)胞. 直接在培養(yǎng)板中加入Trizol裂解細(xì)胞,每10cm2面積加1ml Trizol.用取樣器吹打幾次. 注意:Trizol加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定,不是由細(xì)胞數(shù)決定.如果Trizol加量不足,可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染. d)細(xì)胞懸液: 離心取細(xì)胞,每5-10×106動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每107細(xì)菌細(xì)胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗滌細(xì)胞,以免降解mRNA。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{儀處理。 e)血液處理: 直接取新鮮的血液,加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液,混勻后室溫放置10min,10 000rpm 離心1min。棄上清,收集白細(xì)胞沉淀。每1ml血液收集的白細(xì)胞沉淀中加入1ml Trizol。 2.將勻漿樣品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 3.可選步驟:4 ℃ 10 000rpm離心10min,取上清。 1.如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物結(jié)節(jié)部分等,可離心去除。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時(shí),上層是大量油脂,應(yīng)除去。取澄清的勻漿溶液進(jìn)行下一步操作。 4.每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,蓋好管蓋,劇烈震蕩15s,室溫放置3min。如不能渦旋混勻,可手動(dòng)顛倒混勻2min代替。 5.4 ℃ 10 000rpm離心10-15min,樣品會(huì)分成三層:紅色的有機(jī)相,中間層和上層無色的水相,RNA主要在水相中,把水相(約600ul,約為所用Trizol試劑的60%)轉(zhuǎn)移到新管中。(如要分離蛋白質(zhì)和DNA,可保留黃色的有機(jī)相) 6.在得到的水相溶液中加入等體積的異丙醇,混勻,-20℃ 放置20-30min。 2.植物或動(dòng)物組織RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,導(dǎo)致電泳檢測(cè)時(shí)看不到RNA�？梢园匆韵虏襟E操作減輕污染:在上清中加入1/2體積的異丙醇,1/2體積的RNA助沉劑,然后進(jìn)行以下操作。 7.4 ℃ 10 000rpm離心10min,去上清。 3.離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的,離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。 8.加入1ml 75%乙醇(DEPC水處理過的水配制)洗滌沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。 9.4 ℃ 10 000rpm離心2min,棄上清;短暫快速離心,用移液器小心吸棄上清,注意不要吸棄沉淀。 10.室溫放置晾干(不要晾得過干,RNA完全干燥后會(huì)很難溶解,大約晾干2-3min左右即可)。加入適量DEPC水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次,充分溶解RNA。如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。 RNA提取的注意事項(xiàng) 1. 從少量樣品中提取RNA(1-10mg組織或102-104細(xì)胞) : 加800ul Trizol,樣品裂解后加氯仿,分層,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free糖原,糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來,糖原濃度不高于4mg/ml時(shí)不會(huì)影響反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成,也不影響PCR反應(yīng)。 2. 勻漿后,加氯仿前,樣品可在-70 ℃放置一個(gè)月以上: RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 ℃一個(gè)星期或-20 ℃一年以上。如果要長(zhǎng)期保存,RNA可以溶解于100%去離子甲酰胺中,-70 ℃長(zhǎng)期保存。 |
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