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[交流]
抗真菌肽研究進(jìn)展
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摘 要 ：有害真菌已造成植物真菌病害、食物污染和人類真菌感染等問題，給人們的生活和生產(chǎn)帶來極大危害，且其逐漸增加對(duì)抗真菌藥物的耐藥性，導(dǎo)致真菌防治日益困難。傳統(tǒng)的合成類抗真菌藥物具有藥物殘留和毒副作用，已不能滿足需求，作為生物機(jī)體天然防御分子的抗真菌肽已成為應(yīng)對(duì)真菌危害及耐藥性的重要研究對(duì)象�？拐婢哪軌蛞种朴泻φ婢�，具有高效、廣譜、安全的特性，且其獨(dú)特的抑菌機(jī)理解決了真菌耐藥性的問題，在真菌防治中逐漸受到關(guān)注�；诖�，主要從真菌的危害以及抗真菌肽的來源、分離純化方法、抑菌機(jī)理等幾個(gè)方面進(jìn)行分析與論述，以期為抗真菌肽的研究提供參考。 目前，植物真菌病害、食物污染和真菌感染給我們的生活和生產(chǎn)造成了極大的損失，同時(shí)真菌抗藥性進(jìn)一步增加了真菌的防治難度。抗真菌肽具有獨(dú)特的作用機(jī)理，且不易產(chǎn)生耐藥性，成為化學(xué)抗真菌劑的理想替代品［1］。抗真菌肽是一類由生物體產(chǎn)生的、用于抵御外界真菌侵害的小分子多肽，通常由 10-50 個(gè)氨基酸組成，帶正電荷（+2 到 +9），具有兩親性［2］。隨著研究的進(jìn)行，發(fā)現(xiàn)某些抗真菌肽不僅對(duì)真菌、病毒、原蟲和癌細(xì)胞等具有殺滅作用，還具有提高免疫力、加速傷口愈合等作用。相對(duì)于抗細(xì)菌肽，抗真菌肽的研究起步較晚。目前，抗菌肽數(shù)據(jù)庫（APD）中約有 2 700 多種抗細(xì)菌肽，而具有抗真菌活性的肽僅有 1 043 種。雖然抗菌肽每年以 100 種左右的速度在增加，但抗真菌肽的數(shù)量還遠(yuǎn)少于抗細(xì)菌肽［3-4］。因此，研究與開發(fā)新型抗真菌肽，對(duì)于解決真菌污染具有重要的研究意義。 1 真菌的危害 真菌（Fungus）是獨(dú)立于植物、動(dòng)物和其他真核生物的一類重要微生物，它比病毒或細(xì)菌更加復(fù)雜。一方面，真菌表現(xiàn)出有益的特性，如部分真菌可以應(yīng)用于酒類、面包、調(diào)味品等的發(fā)酵釀造，部分真菌可以分泌凝集素、抗真菌肽、酶制劑等［5］；另一方面，真菌也表現(xiàn)出危害性，如植物病原真菌引起植物真菌病害，食物腐敗真菌則污染糧食和食品，而人類病原真菌直接導(dǎo)致人體真菌感染。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，約 80% 的植物病害是由真菌引起的，發(fā)展中國(guó)家農(nóng)作物的損失有 12% 以上是由真菌病害造成的［6］。常見的有霜霉病、白粉病、銹病、黑粉病、稻瘟病菌、玉米絲黑穗病、土豆晚疫病等真菌病害，對(duì)農(nóng)作物的損傷極為嚴(yán)重［7］。許多食物，如水果、蔬菜、乳制品、肉制品、烘焙食品極易受到真菌污染，真菌的繁殖導(dǎo)致食品的腐敗，部分菌株還會(huì)產(chǎn)生真菌毒素。這些毒素中部分是致癌物，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅［8-9］。此外，糧食儲(chǔ)備期間，也會(huì)由于真菌的污染而發(fā)生霉變，造成極大損失，目前減少儲(chǔ)糧真菌污染的有效殺滅手段還未出現(xiàn)［10］。真菌不僅危害植物、食物，還對(duì)人類的健康構(gòu)成威脅，其中約有 400 種真菌可引起人類多種皮膚病和各種器官疾�。�11-13］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)展中國(guó)家約有 45 億人已受到不同致病真菌的威脅［6］。大多數(shù)人對(duì)真菌感染具有很強(qiáng)的免疫力，然而，當(dāng)免疫系統(tǒng)崩潰時(shí)，真菌往往會(huì)引起疾病。 目前，針對(duì)真菌危害的主要防治手段是使用化學(xué)農(nóng)藥、食品防腐劑或臨床抗真菌藥物。但這些物質(zhì)的使用一方面促使真菌產(chǎn)生抗藥性 ；另一方面，隨著食物鏈的傳遞，化學(xué)農(nóng)藥最終會(huì)在人體內(nèi)富集或殘留。因此，高效、安全、無殘留的抗真菌肽應(yīng)運(yùn)而生，開發(fā)新型抗真菌肽成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，抗真菌肽的開發(fā)與應(yīng)用是一個(gè)具有潛力的真菌防治手段［14-18］。 2 抗真菌肽的來源及分離純化 生物體能夠產(chǎn)生多種防御蛋白，使自己免受微生物、病原體和其他有害生物的入侵。這些蛋白主要有抗細(xì)菌蛋白、抗真菌蛋白、核糖體滅活蛋白、凝集素、核糖核酶和蛋白抑制劑等。Boman 等［19］首先從天蠶蛹淋巴液中發(fā)現(xiàn)了抗細(xì)菌性蛋白物質(zhì)，經(jīng)研究為抗菌多肽，后來發(fā)現(xiàn)其同樣具有抗真菌作用。此后，人們從不同生物體中相繼發(fā)現(xiàn)了抗真菌肽，除了從自然界中獲取抗真菌肽，還可以人工合成抗真菌肽［20］。 不同生物體中抗真菌肽的結(jié)構(gòu)不同、穩(wěn)定性也存在差異，因此采用的分離純化方法也不盡相同，目前還未形成一套標(biāo)準(zhǔn)的抗真菌肽純化方法。但純化操作主要包括原料的前處理、抗真菌肽的初步分離和抗真菌肽的純化。首先根據(jù)抗真菌肽的來源確定原料的前處理方式，然后根據(jù)抗真菌肽的性質(zhì)采取不同的分離純化方法。初步分離方法主要有 ：鹽析沉淀、等電點(diǎn)沉淀、低溫有機(jī)溶劑沉淀、熱沉淀、吸附法、透析和超濾等。上述方法只能獲得多肽的粗提物，若想獲得純品還需進(jìn)一步進(jìn)行純化處理。純化方法主要包括電泳法、層析法（離子交換層析、凝膠過濾層析、親和作用層析等）和反相高效液相色譜法等。這些方法通常需要聯(lián)合使用，才能達(dá)到抗真菌肽的純化目的。 2.1 動(dòng)物源抗真菌肽 2.1.1 來源 大部分動(dòng)物（包括脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物）可通過防御系統(tǒng)合成多肽類物質(zhì)，以應(yīng)對(duì)細(xì)菌和真菌的感染，還可以對(duì)病毒、原生動(dòng)物的入侵做出反應(yīng)。目前動(dòng)物源抗真菌肽主要有昆蟲抗真菌肽、海洋動(dòng)物抗真菌肽、藥用動(dòng)物抗真菌肽等。 昆蟲抗真菌肽作為一類動(dòng)物源抗真菌肽已被廣泛研究，目前已發(fā)現(xiàn)有幾十種昆蟲抗真菌肽。昆蟲在脂肪體（相當(dāng)于高等動(dòng)物的肝臟）中表達(dá)抗菌肽，并在細(xì)菌或真菌感染時(shí)將其分泌到血淋巴（相當(dāng)于高等動(dòng)物的血液）中［16］。研究者利用致病真菌感染昆蟲的方法獲得抗真菌肽。Al 等［21］將釀酒酵母注射到煙草天蛾昆蟲幼蟲體內(nèi)，從幼蟲血淋巴中分離出了一種多肽，具有抗真菌活性。Maistrou 等［22］研究了白僵菌自然感染黃粉蟲過程中產(chǎn)生的抗真菌肽，并測(cè)定了其對(duì)白僵菌的生物活性。 在海洋動(dòng)物方面，抗菌肽主要來源于海洋無脊椎動(dòng)物，包括刺胞動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、軟體動(dòng)物、甲殼動(dòng)物、棘皮動(dòng)物和魚類等［23］。Rose 等［24］從七鰓鰻（最原始的魚類，只有先天免疫能力）中分離到了兩種抗菌物質(zhì) ：溶菌酶和抗真菌肽。經(jīng)證實(shí)，溶菌酶對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌有效，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌或真菌無效 ；而抗真菌肽對(duì)青霉菌和曲霉菌具有抑菌活性。Carlos 等［25］對(duì)海洋蝸牛抗真菌肽進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)這種肽具有抑制酵母菌和絲狀真菌生長(zhǎng)的能力，且對(duì)哺乳動(dòng)物沒有毒副作用。目前來自海洋動(dòng)物的抗真菌肽種類較少，具有很大的開發(fā)空間。 從藥用動(dòng)物中提取抗真菌肽也是抗真菌肽的一種來源方式。Choi 等［26］從成年蜈蚣（節(jié)肢動(dòng)物，在醫(yī)學(xué)上被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療）中獲得一種新的牛乳鐵蛋白肽（LBLP）。結(jié)果表明，LBLP 對(duì)真菌具有抑菌或殺菌活性，且不產(chǎn)生溶血性。LBLP通過在細(xì)胞膜上形成孔洞發(fā)揮了強(qiáng)大的抗真菌活性，最終導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡。 值得注意的是，抗真菌肽在動(dòng)物機(jī)體的不同部位會(huì)產(chǎn)生不同的作用。Park 等［27］在對(duì)蜜蜂抗真菌肽的研究中，發(fā)現(xiàn)了一種蜜蜂抑制劑半胱氨酸繩結(jié)（AcICK）肽，它可作為一種抗真菌肽，也可作為一種殺蟲毒素，它在蜜蜂體內(nèi)的先天免疫反應(yīng)中是一種抗真菌肽，在蜜蜂毒液中則是一種殺蟲毒素。此外，在有毒動(dòng)物（如蝎子和蜘蛛）、馬蹄蟹、昆蟲和植物中也發(fā)現(xiàn)了這種半胱氨酸繩結(jié)（ICK）肽［28-29］。這提示我們要注意動(dòng)物源抗真菌肽的多重作用。 2.1.2 分離純化 動(dòng)物源抗真菌肽一般存在于動(dòng)物組織和血淋巴等器官中，不同來源的抗真菌肽采用不同的處理方法。在血淋巴中，Riciluca 等［30］使用抗凝血物質(zhì)收集蜘蛛的血液，離心去除血細(xì)胞，獲得上清液。在動(dòng)物組織中，Carlos 等［25］首先將海洋蝸牛進(jìn)行均質(zhì)化處理，然后離心獲得抗真菌肽的上清液。 樣品初步處理，隨后采用不同的分離方法對(duì)獲得的上清液進(jìn)行純化，如對(duì)蜘蛛上清液進(jìn)行均質(zhì)、酸化，反相高效液相色譜進(jìn)行純化獲得抗真菌肽［30］。對(duì)海洋蝸牛上清液進(jìn)行硫酸銨沉淀、離心、脫鹽，反相高效液相色譜進(jìn)行純化獲得抗真菌肽［25］。 2.2 植物源抗真菌肽 2.2.1 來源 植物被認(rèn)為是地球上生物活性物質(zhì)的最大來源，近年，從植物中獲得的具有生物活性的多肽數(shù)量較多，但用于抑制有害真菌的量較少。目前抗真菌肽主要來源于植物的種子、果實(shí)、莖、葉等部位。 在植物種子方面，Lin等［31-32］首次從當(dāng)?shù)匕撞朔N子中分離出一種與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯著同源性的抗真菌肽，其對(duì)尖孢鐮刀菌和花生球腔菌的菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，還能抑制 HepG2 和 MCF 癌細(xì)胞的擴(kuò)散，具有多種生物活性。白承之等［33］從苦蕎種子中分離出一種抗真菌肽，具有抑制白腐菌、綠色木霉、鏈格孢霉的作用。Ruan 等［34］從蕎麥種子中也獲得一種抗真菌肽，對(duì)植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制活性�？芍�，從植物種子中獲得抗真菌肽是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。 在植物果實(shí)方面，Mandal 等［35］從天南星果中獲得了一種新型抗真菌肽 Tn-AFP1，對(duì)熱帶假絲酵母菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，可以破壞酵母菌生物膜的形成。Wong 等［36］從云南豆中獲得了一種抗真菌肽，能夠抑制鐮刀菌屬和花生球腔菌屬真菌，并對(duì)小鼠白血病細(xì)胞（L1210）、肝癌細(xì)胞（HepG2）和小鼠白血�。∕1）細(xì)胞系的增殖具有抑制作用。同樣的，Ma 等［37］在尼泊爾大紅豆中也分離出一種抗真菌肽，其功效與云南豆分離獲得的肽相差不大，能夠抑制鐮孢菌和花生球腔菌的菌絲生長(zhǎng)，對(duì) L1210 白血病細(xì)胞和 MBL2 淋巴瘤細(xì)胞均具有抗增殖作用�；诖�，我們推測(cè)植物果實(shí)來源的抗真菌肽可能具有多種生物活性。 在植物其他器官方面，如植物葉、莖、花中也分離出了抗真菌肽。Khani 等［38］從木香葉片中提取了抗真菌親水性肽 Skh-AMP1，其對(duì)致病性曲霉菌、念珠菌具有生物抑菌活性。Rogozhin 等［39］在鷹嘴豆草不同器官（葉片、莖、花和種子）中發(fā)現(xiàn)了一種共同的多肽組分 SMamp3，在葉片中含量最高，其次是在莖、花和種子中。分離獲得的這種多肽組分對(duì)植物病原真菌表現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗真菌活性。 2.2.2 分離純化 對(duì)于來源于植物種子、果實(shí)和莖、葉等的抗真菌肽，一般首先要將植物組織進(jìn)行切段粉碎和均質(zhì)化處理。例如，對(duì)天南星果實(shí)果肉進(jìn)行清洗風(fēng)干，采用乙酸溶液進(jìn)行均質(zhì)，離心后獲得抗真菌肽的上清液［35］。對(duì)蛹蟲草則在液氮中用杵將其均質(zhì)，蒸餾水提取，然后離心獲得上清液［40］。對(duì)蕎麥種子清洗風(fēng)干、磨碎、磷酸鹽緩沖液浸提、離心等操作，以獲得上清液［34］。 植物樣品經(jīng)過上述預(yù)處理獲得提取液后再進(jìn)一步進(jìn)行純化，如對(duì)天南星果含肽的上清液進(jìn)行有機(jī)溶劑（丙酮）沉淀、利用反相高效液相色譜法進(jìn)行純化獲得了抗真菌肽［35］。對(duì)豆樹種子均質(zhì)上清液進(jìn)行硫酸銨沉淀、透析，然后經(jīng)過離子交換層析和凝膠過濾層析進(jìn)一步純化多肽［41］。 2.3 微生物源抗真菌肽 2.3.1 來源 微生物是一個(gè)巨大的寶庫，抗真菌肽來源豐富。目前，微生物源抗真菌肽的研究重點(diǎn)是高產(chǎn)多肽微生物的選育。 研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)抗真菌肽的微生物以細(xì)菌為主，主要有芽孢桿菌和類芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、愛媛類芽孢桿菌等。于杰等［42］獲得一株枯草芽孢桿菌 B25，所產(chǎn)的抗真菌物質(zhì)能有效抑制香蕉枯萎病鐮刀菌以及其他幾種熱帶植物病原真菌并具有耐酸和耐熱的特性。Ji 等［43］獲得一株產(chǎn)抗真菌肽的地衣芽孢桿菌，所產(chǎn)抗真菌蛋白具有絲氨酸蛋白酶活性，并具有良好的熱穩(wěn)定性，在植物病原真菌的生物防治方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Naing 等［44］獲得一株愛媛類芽孢桿菌 MA2012，所產(chǎn)抗真菌肽對(duì)植物病原真菌和炭疽病菌、尖孢鐮刀菌、辣椒疫霉菌和立枯絲核菌具有抑菌活性。芽孢桿菌或類芽孢桿菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生芽孢，能夠抵御外界環(huán)境的變化 ；在發(fā)酵代謝過程中會(huì)產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，可以抑制多種有害菌。因此，大量具有產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的芽孢桿菌被分離出來，其他種屬細(xì)菌也能產(chǎn)生抗真菌肽，但種類較少。 除了細(xì)菌， 某些真菌也可以合成抗真菌肽。gargouri 等［45］從當(dāng)?shù)厍咕械玫搅艘环N新型抗菌肽 AcAFP，對(duì)赤霉病菌、黑曲霉、灰霉病菌、鏈孢霉菌等菌的菌絲生長(zhǎng)均具有強(qiáng)烈的抑制作用。Wang［46］和 Chu［47］分別從食用菌杏孢菌子實(shí)體和平菇子實(shí)體內(nèi)分離獲得了抗真菌肽。 海洋中產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的菌株主要是放線菌。如國(guó)家海洋局第一海洋研究所在海洋中分離得到一株海洋鏈霉屬放線菌，對(duì)其發(fā)酵上清液進(jìn)行提取分離， 獲得3 個(gè)單體活性化合物 ：salicylamide（1）、iturin A-2（2）和 daidzein-4'，7-di-α-L-rhamnoside（3），這 3 種物質(zhì)對(duì)植物病原菌稻瘟病菌、黃瓜灰霉病菌、水稻紋枯病菌等均具有抑制活性［48］。馬桂珍實(shí)驗(yàn)室在連云港海域的海泥中分離獲得一株海洋放線菌優(yōu)良菌株 BM-2，分離純化出 4 種具有抑菌作用的活性物質(zhì)，對(duì)多種植物病原真菌及病原細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抑制效果［49］。隨著人們對(duì)陸地微生物資源的大量開發(fā)，發(fā)現(xiàn)新型抗真菌物質(zhì)的可能性在不斷下降。從海洋中篩選產(chǎn)抗真菌肽的菌株是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，但海洋微生物具有特殊的生長(zhǎng)條件，如高鹽、高壓、低溫、低氧和低光照等，對(duì)抗真菌肽菌株的篩選是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。 2.3.2 分離純化 來自于微生物發(fā)酵產(chǎn)生的抗真菌肽，一般存在于發(fā)酵液中，只需通過過濾或離心的方法去除菌體即可獲得含肽的上清液。例如，對(duì)解淀粉芽孢桿菌 BW-13 發(fā)酵液進(jìn)行離心，0.22 μm 微孔過濾器過濾，獲得發(fā)酵濾液，然后進(jìn)行分離［50］。對(duì)枯草芽孢桿菌 1.88 株發(fā)酵液進(jìn)行離心，去除菌體和沉淀，然后進(jìn)行后續(xù)操作［51］。 獲得含肽上清液后，再經(jīng)過后續(xù)初步分離和純化進(jìn)行分離。微生物來源的抗真菌肽種類較多，其分離純化方法也較多，目前用于分離純化蛋白質(zhì)的方法亦可以用在抗真菌肽的純化中。如鹽析沉淀法、等電點(diǎn)沉法淀、超濾或納濾技術(shù)、吸附技術(shù)、分子篩層析技術(shù)、離子交換層析技術(shù)、高效液相色譜分離技術(shù)等［50-54］。Zhao 等［52］ 在發(fā)酵液中加入硫酸銨，其飽和度為 30%-40%，從芽孢桿菌 BH072 發(fā)酵液中獲得粗提液，然后利用 Sephadex G-75 凝膠過濾、D201 樹脂陰離子交換層析進(jìn)行純化，獲得了抗真菌肽。Rong 等［53］采用甲醇萃取法從內(nèi)生芽孢桿菌 B21 發(fā)酵液中獲得粗提液，后經(jīng)硅膠柱層析、高效液相色譜法進(jìn)行純化，獲得了抗真菌肽。Skourigargouri 等［45］將曲霉菌發(fā)酵上清液在 70℃條件下處理 10 min，經(jīng)過離心去除沉淀，然后進(jìn)行超濾和反相高效液相色譜純化，獲得了抗真菌肽。嚴(yán)海嬌等［54］在發(fā)酵液中加入硫酸銨，其飽和度為 70%，從短小芽孢桿菌 HN-10 發(fā)酵液中獲得多肽沉淀物，然后采 用 AB-8 大 孔 吸 附 樹 脂、Sephadex G-100 凝 膠 和半制備型反相高效液相色譜進(jìn)行純化，獲得了抗真菌肽 P-1。 在抗真菌肽分離純化操作中，具體采用的方法要根據(jù)發(fā)酵液的特點(diǎn)進(jìn)行選擇，同時(shí)還應(yīng)考慮肽的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑穩(wěn)定性等特性。表1匯總了部分抗真菌肽的提取、分離與純化方法。 圖片 2.4 人工合成抗真菌肽 天然來源的抗真菌肽雖然種類豐富，但其或多或少具有含量低、穩(wěn)定性低、分離提取步驟繁瑣、成本高等缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，采用基因工程技術(shù)和生物信息學(xué)手段實(shí)現(xiàn)抗真菌肽的人工合成，這也逐漸成為抗真菌肽來源的重要方式之一［20］。Garibotto 等［55］ 基于抗真菌肽的陽離子性、兩親性、氨基酸長(zhǎng)度及序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)等特性，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，合成了一系列新的含有 9 或 11 個(gè)氨基酸的小肽，它們具有潛在的抗真菌作用，其中肽段 RQWKKWWQWRR-NH2、RQIRRWWQWRR-NH2 和 RQIRRWWQW-NH2 對(duì)致病性新生隱球菌和白念珠菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。這些研究有助于人們了解抗真菌肽的基本結(jié)構(gòu)，并通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)合成相關(guān)的抗真菌藥物。 人們利用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)天然來源的抗真菌肽進(jìn)行改造，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和抗菌活性。羅振華等［56］對(duì)MAF-1（家蠅幼蟲血淋巴分離的一個(gè)抗真菌肽）的結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行人工改造，獲得了一個(gè)含 26 個(gè)氨基酸的抗菌肽 MAF-1A，對(duì)白色念珠菌及其耐藥菌均具有良好的抗菌活性。陳明明［57］又以抗真菌肽MAF-1A 為模板，采用氨基酸替代法對(duì)其氨基酸序列 進(jìn) 行 改 造， 獲 得 了 MAF-1C、MAF-1D、MAF-1E三種衍生肽，并對(duì)其活性進(jìn)行了比較MAF-1C 對(duì)白色念珠菌的抑菌活性明顯優(yōu)于模板肽，且對(duì)白色念珠菌生物膜的形成以及成熟生物膜均具有抑制活性。 人們還利用基因工程技術(shù)把抗真菌肽基因轉(zhuǎn)入植物中以抵御植物有害真菌的侵?jǐn)_。FernandezBidondo 等［58］把編碼抗真菌肽的基因?qū)腭R鈴薯中，獲得了表達(dá)抗真菌蛋白的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系，并監(jiān)測(cè)了抗真菌肽的過度表達(dá)對(duì)非目標(biāo)土壤微生物（叢枝菌根真菌）的影響，表明轉(zhuǎn)基因馬鈴薯具有抵御有害真菌的能力，且對(duì)叢枝菌根真菌的定植及生長(zhǎng)無影響。Banzet 等［59］研究了來自昆蟲的兩種抗真菌肽 drosomycin 和 heliomicin 對(duì)體外植物病原真菌的抑制活性，并將其基因轉(zhuǎn)入煙草中。這兩種基因在煙草中均能夠表達(dá)，并且對(duì)植物病原真菌的抑制活性還有所增加。此外，也有人利用酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)抗真菌肽，Sang 等［60］把果蠅中編碼抗真菌肽的基因在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的抗真菌肽成功分泌到培養(yǎng)基中，并對(duì)試驗(yàn)真菌表現(xiàn)出了抑制活性。表 2 總結(jié)了不同來源的抗真菌肽及其所具備的生物活性。 圖片 2.5 快速篩選與純化方法 在抗菌肽的分離純化中，傳統(tǒng)的方法復(fù)雜繁瑣，近年來，研究者開發(fā)了一系列抗菌肽的快速篩選與純化方法，如抗菌肽 - 細(xì)菌吸附結(jié)合法、細(xì)胞色譜法、模擬細(xì)胞膜色譜法、毛細(xì)血管法、薄層色譜自顯影法和高通量鑒定法等［61］。唐文婷［62］研究了基于肽 - 膜相互作用的模擬細(xì)胞膜的抗菌肽篩選方法，根據(jù)抗菌肽與模擬細(xì)胞膜的相互作用原理，建立了一套高效、快速的抗菌肽篩選與純化方法。目前，關(guān)于抗真菌肽快速篩選與純化方面的報(bào)道較少，但隨著研究的深入，這些方法在抗真菌肽的快速篩選方面將發(fā)揮重要的作用。 特別是 Marie 等［63］提出了一種基于 diS-C3（3）熒光探針的方法，能夠在 96 孔板中進(jìn)行高通量篩選抗菌物質(zhì)，并利用從蜜蜂毒液中分離的抗菌肽 LLIII（具有抗真菌活性）、它的合成類似物 LL-III /12和奧替尼啶雙鹽酸鹽類似物 MAC-1/31（具有抗真菌活性），這 3 種物質(zhì)進(jìn)行抗真菌物質(zhì)高通量篩選方法的驗(yàn)證，證明了該方法的可靠性。 研究者從不同來源的材料中獲得了抗真菌肽，來源最多的是微生物源抗真菌肽。隨著研究的深入，具有抗細(xì)菌、抗真菌作用的微生物已經(jīng)被廣泛分離出來，資源相對(duì)枯竭。從海洋中篩選具有抗真菌作用的微生物是一個(gè)新的選擇，但需要面臨的是海洋特殊的生理?xiàng)l件及后續(xù)的發(fā)酵生產(chǎn)，這些都是抗真菌肽資源開發(fā)中的挑戰(zhàn)。從動(dòng)物和植物中分離獲得的抗真菌肽相對(duì)較少，重點(diǎn)在于對(duì)動(dòng)物和植物資源的選擇，一些本身具有抗菌作用的動(dòng)物和植物能提高獲得抗真菌肽的機(jī)率，如藥用植物和藥用動(dòng)物。在人工合成方面，抗真菌肽數(shù)據(jù)庫的建立和結(jié)構(gòu)解析更有利于改造或合成更多穩(wěn)定性高、毒性低的抗真菌肽。 抗真菌肽分離純化的手段多是常見的分離蛋白質(zhì)的方法，程序比較繁瑣，近年來，高通量快速篩選方法的確立加速了抗真菌肽的開發(fā)進(jìn)程，值得人們嘗試。 3 抗真菌肽的抑菌機(jī)理 目前對(duì)抗菌肽抑菌機(jī)理的研究，多集中于抗細(xì)菌，且研究得較為全面，但對(duì)抗真菌機(jī)理的研究較少。不同于細(xì)菌，真菌細(xì)胞壁成分復(fù)雜，且存在如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等特有細(xì)胞器。因此，對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)理研究不能完全涵蓋對(duì)真菌的作用。抗真菌肽抑制真菌的機(jī)理研究主要集中于對(duì)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、胞內(nèi)大分子 DNA 和蛋白質(zhì)的作用。 3.1 對(duì)真菌細(xì)胞壁的作用 真菌細(xì)胞壁是細(xì)胞正常生長(zhǎng)和維持生理功能所必須的一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠?qū)辜?xì)胞的膨壓，防止細(xì)胞裂解，對(duì)于維持真菌細(xì)胞的形狀和完整性至關(guān)重要。真菌細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白、脂質(zhì)等組成（圖 1）。通常采用電子顯微鏡（掃描電鏡、透射電鏡、原子力顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等）結(jié)合熒光探針標(biāo)記技術(shù)研究抗真菌肽對(duì)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的作用［70］。Mizuhara 等［71］從一株鏈霉菌 HA125-40 發(fā)酵上清液中分離獲得一種抗真菌環(huán)肽——環(huán)噻嗪霉素 B1（CTB1），結(jié)果顯示，CTB1 主要通過與幾丁質(zhì)結(jié)合而引起了細(xì)胞壁的破裂，從而導(dǎo)致了真菌細(xì)胞的死亡�？拐婢倪�能導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，高霞［72］利用透射電鏡觀察到酵母菌經(jīng)抗真菌肽 APS 處理后，細(xì)胞壁出現(xiàn)裂口，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，胞漿內(nèi)容物泄漏，細(xì)胞出現(xiàn)空泡。 圖片 3.2 對(duì)真菌細(xì)胞膜的作用 抗真菌肽對(duì)細(xì)胞膜的滲透作用，這一過程主要取決于抗菌肽和目標(biāo)細(xì)胞膜的物理化學(xué)性質(zhì)。目前，關(guān)于抗菌肽滲透細(xì)胞膜的機(jī)制已經(jīng)形成 3 個(gè)作用模型 ：桶板模型、毯式模型（圖 2）和環(huán)型模型［73-75］。例如，Choi 等［2］研究抗真菌肽 astacidin 1 抑制白色念珠菌和毛孢子菌的抑菌機(jī)理，通過流式細(xì)胞檢測(cè)和 K+ 釋放測(cè)定表明，細(xì)胞膜發(fā)生滲透和 K+ 釋放誘導(dǎo)的膜去極化。通過模擬白色念珠菌膜脂質(zhì)體的鈣素滲漏實(shí)驗(yàn)表明，膜的滲透作用是由成孔機(jī)制驅(qū)動(dòng)的。Jin 等［76］獲得一種抗真菌脂肽桿菌霉素 D，利用掃描電鏡和透射電鏡研究它對(duì)炭疽病菌的抑菌機(jī)理，結(jié)果表明，它主要損傷炭疽病菌的菌絲和孢子，并使細(xì)胞膜形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器滲出。Han 等［77］研究了芽孢桿菌 L-H15 分泌的新型抗真菌環(huán)肽 P852 對(duì)尖孢鐮刀菌細(xì)胞形態(tài)和膜透性的影響，通過電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、透射電鏡和熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，P852 引起了尖孢鐮刀菌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞膜形成孔洞、胞內(nèi)組織被破壞、最終細(xì)胞裂解死亡。 圖片 3.3 對(duì)真菌細(xì)胞器及胞內(nèi)大分子的作用 真菌細(xì)胞器主要有線粒體、核糖體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、鞭毛等。抗真菌肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的作用主要包括 ：阻斷細(xì)胞內(nèi)核酸的合成、抑制細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)合成、抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性等（圖 3）。有時(shí)，抗真菌肽對(duì)真菌的抑制作用是通過對(duì)細(xì)胞膜的滲透作用以及對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞器共同作用的結(jié)果。Lee 等［78］研究了人工合成的 14-螺旋b肽與人工合成脂質(zhì)囊泡膜之間的相互作用，研究結(jié)果表明，14-螺旋b肽對(duì)人工合成脂質(zhì)囊泡膜具有滲透作用 ；進(jìn)一步采用熒光標(biāo)記法追蹤 b 肽在細(xì)胞內(nèi)的定位，結(jié)果顯示，b 肽進(jìn)入細(xì)胞后，依次破壞細(xì)胞核和液泡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 圖片 通常采用SDS電泳、DNA凝膠阻滯、熒光光譜分析、流式細(xì)胞技術(shù)、蛋白質(zhì)印記法等方法研究抗菌肽進(jìn)入胞內(nèi)的作用情況［70］。采用 qPCR 轉(zhuǎn)錄組學(xué)和 iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過生物信息學(xué)分析抗菌肽作用后關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)差異，研究對(duì)胞內(nèi)大分子 DNA 和蛋白質(zhì)的抑制作用［79-80］。Han 等［81］利用 iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析串珠鐮刀菌經(jīng)抗真菌肽 AMP-jsa9 處理后的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)有 162 個(gè)差異表達(dá)蛋白（59 個(gè)上調(diào)，103 個(gè)下調(diào)），同時(shí)，AMP-jsa9 還導(dǎo)致了幾丁質(zhì)、麥角固醇、NADH、NADPH和ATP表達(dá)水平的降低。 綜上可知，抗真菌肽一般通過對(duì)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、胞內(nèi)大分子單獨(dú)作用或共同作用來達(dá)到抑制或殺死真菌的作用。 在對(duì)抗真菌肽抑菌機(jī)理的研究中，對(duì)真菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的作用和對(duì)細(xì)胞器及胞內(nèi)大分子的作用是研究者重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容，也是抑菌機(jī)理研究的基礎(chǔ)內(nèi)容。近年來興起的qPCR轉(zhuǎn)錄組學(xué)和 iTRAQ 定量分析蛋白組學(xué)技術(shù)具有快速、靈敏、定量分析的優(yōu)點(diǎn)，主要是利用生物信息學(xué)分析抗菌肽作用前后關(guān)鍵基因和蛋白的表達(dá)差異，已經(jīng)被越來越多的研究者所應(yīng)用。在抗菌機(jī)理的研究中，把基礎(chǔ)技術(shù)和新型技術(shù)相結(jié)合，能更好闡明抗真菌肽的抑菌機(jī)理。 4 結(jié)語 隨著有害真菌抗藥性的增加，抗真菌肽由于其獨(dú)特的抑菌機(jī)理進(jìn)入了人們的視線，開發(fā)新型抗真菌肽成為研究的趨勢(shì)。圍繞抗真菌肽，研究者進(jìn)行了廣泛的研究，但仍需關(guān)注以下幾方面 ：（1）尋找穩(wěn)定性好、對(duì)機(jī)體無毒副作用的抗真菌肽仍然是目前的任務(wù)之一 ；（2）對(duì)現(xiàn)有抗真菌肽作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)與探索，以及解決目前分離純化成本高的問題也是抗真菌肽研究的一個(gè)方面 ；（3）植物生防菌株的篩選，以及將不同來源的抗真菌肽應(yīng)用到植物真菌病害防治和食品防腐中，也是需要關(guān)注的方向 ；（4）在應(yīng)對(duì)人類真菌感染上，將抗真菌肽與現(xiàn)有抗真菌藥物聯(lián)合使用是研究的一個(gè)方向，這樣不僅可以提高治療效果，還能夠降低二者用量。 免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者所有，如有侵權(quán)，可刪除 |
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