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氨基酸薄層層析實(shí)驗(yàn)方法
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【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 (一) 試劑 1. 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(10mg/ml)：三種氨基酸是賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸，分別配成上述濃度的溶液。 2. 氨基酸混合液（每種氨基酸5mg/ml） 3. 展層劑：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V） 4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。 (二) 器材 聚酰胺薄膜，毛細(xì)管，層析裝置，電吹風(fēng)機(jī)，噴霧器， 塑料手套等。 【實(shí)驗(yàn)方法】 (一) 薄膜的剪裁 取薄膜（7cm×10cm）一張，在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一直線，在此直線上每隔1厘米作一記號為點(diǎn)樣處（外側(cè)兩點(diǎn)距邊緣2cm）。 (二) 點(diǎn)樣 氨基酸的點(diǎn)樣量以5ul為宜。點(diǎn)樣時，用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品，與薄膜垂直方向輕輕碰點(diǎn)樣處，每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過2mm。點(diǎn)樣過程中，必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴。為加快樣品干燥，可用吹風(fēng)機(jī)吹干，注意溫度不宜過高，以免損壞氨基酸。 (三) 展層 在層析缸中放一個小培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿中倒入適量展層劑，將點(diǎn)好樣品的薄膜斜立于培養(yǎng)皿中（注意點(diǎn)樣的一端在下），展層劑的液面需低于點(diǎn)樣線１厘米。當(dāng)溶劑前沿距上邊緣１厘米處時，取出膜片，立即用筆標(biāo)出溶劑前沿的位置，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)吹干。 （四）定性鑒定 用0.1％茚三酮－正丁醇液在薄膜的一面均勻噴霧。晾干后，用一直尺測量每一顯色斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，求其比值，即得各種氨基酸的Rf值。 在層析圖譜上，對比標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的位置（Rf值），確定氨基酸混合樣中氨基酸的種 類及位置。 【注意事項(xiàng)】 1. 選用合適、潔凈的薄膜。勿用手直接接觸薄膜。 2. 點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大（其直徑應(yīng)小于2mm）。吹風(fēng)機(jī)溫度不宜過高，否則斑點(diǎn)變黃。 3. 根據(jù)一定目的、要求，選擇合適的溶劑系統(tǒng)。 作者：畢合生物 公眾號：畢合生物 畢合生物( www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細(xì)胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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