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科研小努力新蟲 (小有名氣)
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實(shí)驗(yàn)技巧 | 7種較常見的流式疑難問題解析
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1. 無信號(hào)/熒光強(qiáng)度弱 信號(hào)補(bǔ)償不正確 檢查流式細(xì)胞儀上單色陽性對(duì)照是否設(shè)置正確，以及門控和補(bǔ)償設(shè)置是否正確，確保您能捕獲所有事件。 用于檢測(cè)的抗體不足 增加抗體量或抗體濃度。 無法接近細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo) 檢查靶蛋白是否是位于細(xì)胞內(nèi)，或者膜蛋白的抗體表位是否位于細(xì)胞內(nèi)。關(guān)于細(xì)胞內(nèi)染色，確保充分透化。為防止細(xì)胞表面蛋白質(zhì)發(fā)生內(nèi)化，所有操作步驟必須在冰上或 4℃ 下用預(yù)冷的交聯(lián)試劑完成，以阻止所有細(xì)胞反應(yīng)。 在實(shí)驗(yàn)試劑中添加疊氮化鈉可阻止表面抗原的調(diào)變和內(nèi)化，但會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度損失。對(duì)于粘附細(xì)胞系的染色，胰蛋白酶通常可以誘使細(xì)胞表面蛋白發(fā)生內(nèi)化，并且可能需要更溫和的分離方法。 細(xì)胞內(nèi)染色 - 熒光染料結(jié)合分子太大 細(xì)胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用小分子量的熒光染料。分子量大的熒光染料會(huì)降低抗體活性，阻止抗體進(jìn)入細(xì)胞標(biāo)記目標(biāo)蛋白。 激光器未對(duì)齊 確保流式細(xì)胞儀上的激光器正確對(duì)齊，必要時(shí)通過運(yùn)行液流檢查微珠來調(diào)整路線。如果激光器未正確對(duì)齊或發(fā)生偏移，則可能需要考慮維修機(jī)器。 靶蛋白不存在/低水平表達(dá) 確保您正在分析的組織/細(xì)胞類型能表達(dá)靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被檢出。 可溶性/分泌性靶蛋白 靶蛋白是否可溶并由細(xì)胞分泌？靶蛋白需要嵌合在細(xì)胞膜上或存在于細(xì)胞質(zhì)里，以便輕松通過流式細(xì)胞術(shù)檢出。通過高爾基體封閉步驟，例如加入 Brefeldin A，可以改善細(xì)胞內(nèi)的染色信號(hào)。 補(bǔ)償過高/增益過低 使用陽性對(duì)照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀，利用補(bǔ)償確保細(xì)胞的熒光信號(hào)不被切斷，提高增益以增強(qiáng)信號(hào)（在合理范圍內(nèi) - 應(yīng)謹(jǐn)慎操作）。 熒光染料的熒光消退 抗體可能存放太久或沒有避光。需要新鮮抗體。 一抗和二抗不匹配 使用的二抗應(yīng)與一抗來源種屬不同（例如，一抗為兔源，則應(yīng)該使用抗兔源二抗）。為了解決種屬交叉反應(yīng)性的問題，您可以使用經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證的直接偶聯(lián)一抗，或者使用偶聯(lián)物試劑盒，在您選擇的抗體中加入合適的熒光染料。 2. 熒光強(qiáng)度高 抗體濃度過高 會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)非特異性結(jié)合或高熒光強(qiáng)度。減少每個(gè)樣本中添加的抗體量。 過量抗體被捕獲 可能是胞內(nèi)染色特有的問題，這種情況下，抗體上的大熒光染料分子可能被捕獲在細(xì)胞內(nèi)。確保洗滌步驟充分，并在洗滌緩沖液中加入吐溫或Triton，以保持細(xì)胞的透化作用。 封閉不足 在您的抗體混合液中加入1%-3%封閉劑，并增加封閉步驟。 3. 背景高/陽性細(xì)胞百分比高 增益設(shè)置過高/補(bǔ)償過低 使用陽性對(duì)照正確設(shè)置流式細(xì)胞儀，使用補(bǔ)償減少小顆粒背景信號(hào)并減少增益，以降低信號(hào)。 抗體過量 降低抗體濃度。還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，確保洗去過量的抗體。 4. 在應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞群的情況下觀察到兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群 表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞群不止一個(gè) 檢查樣本包含的細(xì)胞類型的預(yù)期蛋白表達(dá)水平，如有必要，確保細(xì)胞充分分離。 出現(xiàn)細(xì)胞雙峰 細(xì)胞雙峰顯示為第二大細(xì)胞群，其熒光強(qiáng)度大約是單細(xì)胞熒光強(qiáng)度的兩倍。染色前用移液槍將細(xì)胞輕柔混勻，放入細(xì)胞儀中運(yùn)行前再次混勻。也可以篩選或過濾細(xì)胞，以去除團(tuán)塊（30μL尼龍網(wǎng)）。 5. 側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒） 細(xì)胞裂解 確保樣本中的細(xì)胞沒有裂解和破碎。樣本應(yīng)新鮮，并正確制備。不要在高轉(zhuǎn)速的情況下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心或激烈渦旋。 細(xì)菌污染 確保樣本不受污染。細(xì)菌會(huì)自動(dòng)發(fā)出較弱的熒光，導(dǎo)致高事件率。 6. 低事件率 每毫升的細(xì)胞數(shù)過少 運(yùn)行1×106個(gè)細(xì)胞/mL。確保細(xì)胞混合均勻（輕柔混勻）。 細(xì)胞聚集，阻塞管道 染色前輕輕吹打幾次，確保得到同源單細(xì)胞懸液。確保上機(jī)前再次混勻。極端情況下，可以篩選或過濾細(xì)胞，以去除團(tuán)塊（300目尼龍網(wǎng)）。 7. 高事件率 細(xì)胞數(shù)量過多 稀釋至1×105至1×106個(gè)細(xì)胞/mL。 |
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