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熒光實驗方法的選擇
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在熒光分析中，可以采用不同的實驗方法以進(jìn)行分析物質(zhì)濃度的測量。其中最簡單的是直接測定的方法。只要分析物質(zhì)本身法熒光，便可以通過測量其熒光強(qiáng)度以測定其濃度。許多有機(jī)芳族化合物和生物物質(zhì)有內(nèi)在的熒光性質(zhì)，通�？梢灾苯舆M(jìn)行熒光測定。若有其他干擾物質(zhì)存在時，則應(yīng)預(yù)先采用掩蔽或分離的辦法加以消除。 對于有些物質(zhì)，它們或者本身不發(fā)熒光，或者因熒光量子產(chǎn)率很低而無法進(jìn)行直接測定，便只能采用間接測定的辦法。間接測定的辦法有多種，可按分析物質(zhì)的具體情況加以適當(dāng)?shù)倪x擇。 第一種方法是熒光衍生化的辦法，即通過某種手段使本身不發(fā)光的待分析物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N發(fā)熒光的化合物，再通過測定該化合物的熒光強(qiáng)度，可間接測定待分析物質(zhì)。例如許多無機(jī)金屬離子的熒光測定方法，就是通過使它們與某些金屬螯合劑反應(yīng)生成具有熒光的螯合物之后加以測定的。某些不發(fā)光的有機(jī)化合物，可以通過降解反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、偶聯(lián)反應(yīng)、縮合反應(yīng)、酶催化反應(yīng)或光化學(xué)反應(yīng)等辦法，使它們轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)。例如維生素B1本身不發(fā)熒光，但可在堿性溶液中用鐵青化鉀等一些氧化劑將它氧化為發(fā)熒光的硫胺熒。 如果分析物質(zhì)本身不發(fā)熒光，但卻具有能使某種熒光化合物熒光猝滅的能力，由于熒光猝滅的程度與分析物質(zhì)的濃度有著定量的關(guān)系，那么，通過測量熒光化合物熒光強(qiáng)度的下降程度，便可間接地測定該分析物質(zhì)。例如大多數(shù)過渡金屬離子與具有熒光性質(zhì)的芳族配位體配合后，往往使配位體的熒光猝滅，從而可間接測定這些金屬離子。倘若待分析物質(zhì)不發(fā)熒光，但可以通過選擇合適的熒光試劑作為能量受體，在待分析物質(zhì)受激發(fā)后，通過能量轉(zhuǎn)移的辦法，經(jīng)由單重態(tài)-單重態(tài)（或三重態(tài)-單重態(tài)）的能量轉(zhuǎn)移過程，將激發(fā)能傳遞給能量受體，使能量受體分子被激發(fā)，再通過測定能量受體所發(fā)射的發(fā)光強(qiáng)度，也可以對分析物進(jìn)行間接測定。例如在濾紙上用萘作敏化劑以測定低濃度的蒽時，可使蒽的檢測限提高達(dá)3個數(shù)量級。以此類推，低濃度的菲也可由萘敏化而產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。在熒光分析中，由于每種熒光化合物具有本身的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因而在測定時相應(yīng)的有激發(fā)波長和發(fā)射波長兩種參數(shù)可供選擇，這在混合物的測定方面比分光光度法具有更有利的條件，有時可簡單地通過選擇合適的激發(fā)波長或發(fā)射波長，達(dá)到選擇性測定混合物中某種組分的目的。 在選擇激光波長和發(fā)射波長之后仍無法達(dá)到混合物中各組分的分別測定時，還可仿照分光光度法中聯(lián)合測定并解聯(lián)立方程式的辦法；對于混合物的熒光聯(lián)合測定，也有不采用聯(lián)立方程式而采用校正圖的辦法；對于發(fā)射光譜相互重疊的雙組份或三組分熒光混合物的同時測定，在合適的條件下可應(yīng)用類似于雙波長分光度的原理，采用多波長熒光法進(jìn)行測定。上述這些辦法提出時在當(dāng)時的儀器條件下是有效的、可以解決問題的，對拓寬熒光分析的應(yīng)用范圍是發(fā)揮一定作用的，但畢竟方法比較繁瑣、費(fèi)時。在目前的情況下，由于熒光分析在法學(xué)和儀器方面都有了很大的發(fā)展，就不必采用上述幾種方法，而可以采用更為先進(jìn)的方法，諸如本書后面將要介紹的同步熒光測定、導(dǎo)數(shù)熒光測定、時間分辨熒光測定、相分辨熒光測定等方法，以及化學(xué)計量學(xué)的方法，來達(dá)到分別測定或同時測定的目的。與常規(guī)熒光分析法相比，同步熒光分析法具有簡化譜圖、提高選擇性、減少光散射干擾等特點，尤其適合多組分混合物的分析。同步熒光掃描技術(shù)由Lloyd首先提出，它與常用的熒光測定方法最大的區(qū)別是同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長，由測得的熒光強(qiáng)度信號與對應(yīng)的激發(fā)波長（或發(fā)射波長）構(gòu)成光譜圖，稱為同步熒光光譜。 根據(jù)激發(fā)和發(fā)射兩種波長在同時掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步熒光分析法可分為如下四種類型：第一種類型在同時掃描過程中使激發(fā)波長，這種方法稱為恒（固定）波長同步熒光分析法（constant wavelength synchronous fluorescence spectrometry, CWSFS）,即習(xí)慣上所說的同步熒光法，是最早提出的一種同步掃描技術(shù)；第二種類型則以能量關(guān)系代替波長關(guān)系，在兩個單色器同時掃描過程中使激發(fā)波長與發(fā)射波長之間保持固定的能量差，這種方法稱為恒能量同步熒光分析法(constant-energy synchronous fluorescence spectrometry,CESFS) ；第三種類型稱為可變角（或可變波長）同步熒光法（variable-angle synchronous fluorescence spectrometry,MISFS），其掃描路徑表現(xiàn)為基體（將干擾物視為基體）的等熒光強(qiáng)度線。 同步熒光掃描測定具有如下優(yōu)點：1簡化光譜；2窄化譜帶；3減小光譜的重疊現(xiàn)象；4減小散射光的影響。 三維熒光光譜是近幾十年中發(fā)展起來的一種新的熒光分析技術(shù)。這種技術(shù)區(qū)別于普通的熒光分析的主要特點在于它能獲得激發(fā)波長與發(fā)射波長同時變化時的熒光強(qiáng)度信息。普通熒光分析所測得的光譜是二維譜圖，包括固定激發(fā)波長而掃描發(fā)射（即熒光測定）波長所獲得的發(fā)射光譜，和固定發(fā)射波長而掃描激發(fā)波長所獲得的激發(fā)光譜。但是，實際上熒光強(qiáng)度應(yīng)是激發(fā)和發(fā)射這兩個波長變量的函數(shù)。描述熒光強(qiáng)度同時隨激發(fā)波長和發(fā)射波長變化的關(guān)系圖譜，即為三維熒光光譜。 另外，熒光分析法還有時間分辨和相分辨熒光分析法、熒光偏振測定、低溫?zé)晒夥治龇�、固體表面熒光分析法、動力學(xué)熒光分析法空間分辨熒光分析技術(shù)、單分子熒光檢測、熒光免疫分析法和導(dǎo)數(shù)熒光分析法。固體表面熒光測有兩種方法：一種是直接測定固體物質(zhì)表面的熒光；另一種是將待測組分吸附在固體物質(zhì)表面，然后進(jìn)行熒光測定。才用的固體物質(zhì)品種眾多，有硅膠、氧化鋁、濾紙、硅酮橡膠、乙酸鈉、溴化鉀、蔗糖、纖維素等。固體表面熒光測定有兩種不同形式，一為反射式，一為透射式。采用反射式時，激發(fā)光源和熒光檢測器同在樣品的一邊，一般互成45°角。紫外激發(fā)光聚集于固體表面樣品斑點上，樣品發(fā)生的熒光經(jīng)單色器散射后由檢測器檢測。采用透射式時，一般將樣品吸附在透明的薄層色譜板上，激發(fā)光源和檢測器分處在樣品的兩邊。紫外激發(fā)光經(jīng)濾光片除去可見光，聚集在樣品斑點上而發(fā)可見光熒光，熒光透過薄層板再經(jīng)單色器散射后由檢測器檢測。在固體表面熒光測定中，待測物質(zhì)吸附在固體物質(zhì)的小顆粒上。入射光進(jìn)入固體物質(zhì)而在顆粒的邊界上發(fā)生多重反射，成為漫反射發(fā)生的熒光也在顆粒之間發(fā)生反射，形成了激發(fā)光和熒光兩者的散射。在這樣復(fù)雜的情況下，固體表面發(fā)生的熒光強(qiáng)度除與照射面積和熒光物質(zhì)的數(shù)量有關(guān)外，還受眾多因素的影響，如散射光強(qiáng)度、吸附層厚度、固體顆粒的大小、固體表面對激發(fā)光的吸收、測定的方式、觀測發(fā)光信號的角度等。 |
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