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二肽類代謝物生物學(xué)功能及分析方法研究進(jìn)展
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二肽是由兩個氨基酸殘基組成的寡肽,是機(jī)體吸收蛋白質(zhì)的主要形式之一,其種類繁多,結(jié)構(gòu)多樣,體內(nèi)分布廣泛。二肽在體內(nèi)發(fā)揮著重要的營養(yǎng)學(xué)功能,除參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理功能,還可作為多種疾病的潛在生物標(biāo)志物。人體內(nèi)二肽的濃度范圍可跨越幾個數(shù)量級,存在多種同分異構(gòu)體,其標(biāo)準(zhǔn)品大多難以獲得,目前針對該類代謝物的定量分析方法靈敏度低且覆蓋面窄。本文對二肽類代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收、生理功能和定性定量分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)綜述。 二肽由兩個氨基酸分子通過肽鍵連接形成,平均分子量約260Da。二肽組成簡單但結(jié)構(gòu)多樣,僅20個構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本α-氨基酸就可組成400個二肽。除此之外,體內(nèi)尚有多達(dá)數(shù)百種非必需氨基酸亦可作為二肽的組成單元。現(xiàn)有研究認(rèn)為,人體內(nèi)的二肽類代謝物主要來源于膳食攝入后的蛋白質(zhì)消化吸收和內(nèi)源性蛋白降解,廣泛存在于體液、細(xì)胞和組織等生物樣本中[1-2]。此外,體內(nèi)還有一部分二肽由兩分子游離氨基酸通過酶促反應(yīng)縮合而成[3-4]。二肽在體內(nèi)發(fā)揮著重要的營養(yǎng)學(xué)功能和生物學(xué)功能,近年來有研究報(bào)道,二肽還可作為肺癌、結(jié)腸癌和肝癌等疾病診斷和分型的潛生物標(biāo)志物[5-7]。二肽是機(jī)體內(nèi)一類重要的內(nèi)源性小分子代謝物,分布廣泛、種類繁多、功能多樣,近年來逐步引起人們的關(guān)注。但同分異構(gòu)體多、濃度范圍廣、標(biāo)準(zhǔn)品缺乏也給二肽類代謝物的定性定量分析、生物學(xué)功能研究帶來巨大挑戰(zhàn)。 1 二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收 1.1 吸收 人體內(nèi)二肽類代謝物主要來源于消化道吸收。過去研究認(rèn)為,蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶促水解后,全部以氨基酸的形式被腸道吸收[8]。隨后的研究揭示,人體吸收蛋白質(zhì)的主要形式還包括寡肽,尤其是二肽和三肽,以寡肽形式的蛋白吸收率相比于氨基酸提高了2~2.5倍,這是人體胃腸道吸收蛋白質(zhì)機(jī)制研究的重大突破[9-11]。吸收進(jìn)入細(xì)胞的二肽一部分被胞漿中的肽酶水解后形成游離氨基酸,用于細(xì)胞本身代謝合成或被基底側(cè)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)至體循環(huán);另一部分具有抗水解酶活性的二肽則可直接通過基底側(cè)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)體被完整地轉(zhuǎn)運(yùn)至體循環(huán),之后被血漿中的可溶性蛋白酶降解為氨基酸(見圖1)[12-14]。 圖片 1.2 轉(zhuǎn)運(yùn) 寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(POTs)家族中的PepT1(SLC15A1)、PepT2(SLC15A2)、PHT1(SLC15A4)和PHT2(SLC15A3)是目前已知的人體內(nèi)二肽類代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)體。關(guān)于PepT1和PepT2研究較多,而對PHT1和PHT2研究則較少,其具體功能尚不清楚。PepT1是低親和力、高容量的肽載體,主要在小腸上皮細(xì)胞中表達(dá)。二肽通過PepT1穿過腸上皮,最終進(jìn)入血液循環(huán)、器官及細(xì)胞組織,迅速發(fā)揮生理作用[15]。PepT2是高親和力、低容量的肽載體,主要在腎髓質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的刷狀緣膜側(cè)表達(dá)中表達(dá),可以重吸收腎小球?yàn)V過的二肽[16-17]。二肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要是pH依賴性的H+-Na+交換轉(zhuǎn)運(yùn)體系(見圖1)。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中H+向細(xì)胞內(nèi)電化學(xué)質(zhì)子梯度供能,質(zhì)子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生的動力驅(qū)使二肽以易化擴(kuò)散的形式進(jìn)入細(xì)胞,引起胞漿的pH值下降,進(jìn)而活化Na+-H+通道,H+被釋放出細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)的pH恢復(fù)到初始水平[18]。除二肽轉(zhuǎn)運(yùn)體外,一部分二肽可通過細(xì)胞旁途徑穿過腸上皮膜,直接通過上皮細(xì)胞之間的緊密連接(tight junctions)進(jìn)入細(xì)胞間隙而被吸收[19]。研究發(fā)現(xiàn),二肽轉(zhuǎn)運(yùn)體更傾向于運(yùn)輸帶有中性電荷的極性疏水二肽,而親水性、中性或帶負(fù)電荷、小分子量二肽則更易經(jīng)緊密連接的胞外通路運(yùn)輸[12]。 2 二肽的生物學(xué)功能 2.1 營養(yǎng)調(diào)節(jié)作用 二肽與游離氨基酸的吸收分別依賴于各自的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行(見圖1),既相互獨(dú)立又互為補(bǔ)充。吸收進(jìn)入細(xì)胞的部分二肽可以水解成游離氨基酸,有助于減弱由于游離氨基酸之間相互競爭共同吸收位點(diǎn)而產(chǎn)生的拮抗作用,增加細(xì)胞內(nèi)氨基酸吸收量,加速蛋白質(zhì)合成,從而發(fā)揮營養(yǎng)調(diào)節(jié)作用。Paulussen等[20]研究了Leu-Leu攝入后對餐后肌肉蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝的影響,Leu-Leu通過刺激人體中肌纖維蛋白質(zhì)的合成,從而提高血漿中Leu-Leu的濃度以及肌肉蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)率。Mantuano等[21]對Ala-Ala作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑對骨骼肌萎縮的影響進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)Ala-Ala可以增加支鏈氨基酸的生物利用度,改善肌肉萎縮。另有研究表明,添加Gln-Gln強(qiáng)化的腸外營養(yǎng),可以改善重癥患者的預(yù)后,顯著降低重癥患者的感染率及住院時間[22]。 2.2 生理調(diào)節(jié)作用 2.2.1 促細(xì)胞增殖 已有研究揭示,蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的某些二肽具有促細(xì)胞增殖的作用。成纖維細(xì)胞在傷口愈合中發(fā)揮重要作用,其能形成肉芽組織,合成胞外基質(zhì)化合物。研究發(fā)現(xiàn),小鼠皮膚傷口愈合處內(nèi)源性膠原蛋白降解可產(chǎn)生Pro-Hyp,Pro-Hyp能促進(jìn)附著在膠原蛋白上的成纖維細(xì)胞的生長[23]。Hyp-Gly也被證實(shí)具有促成纖維細(xì)胞增殖的功能[24]。另外,Pro-Hyp還可以提高海馬內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的基因表達(dá),促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖,從而發(fā)揮抗抑郁活性[25]。除上述來自膠原蛋白水解的含有Hyp的二肽外,Tyr-Gly也被證實(shí)具有促進(jìn)人外周血淋巴細(xì)胞增殖的作用[26]。 2.2.2 抗炎活性 炎癥是生物組織受到某種刺激如外傷、感染等損傷因子的刺激所發(fā)生的一種以防御反應(yīng)為主的基本病理過程。一般情況下,炎癥是有益的,但過度炎癥反應(yīng)則會造成機(jī)體損傷,并且炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),多種二肽具有抗炎活性。Ano等[27]報(bào)道,口服Trp-Met可以抑制阿爾茨海默癥模型小鼠大腦炎癥反應(yīng),推斷可能是Trp-Met口服后被輸送到大腦,通過抑制腦內(nèi)單胺氧化酶B的活性,從而抑制大腦中的炎癥反應(yīng)。Engevik等[28]報(bào)道,TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠灌胃給予γ-Glu-Cys后,組織中促炎細(xì)胞因子水平顯著降低,提示該二肽具有抗炎活性。El-Lekawy等[29]研究了Ala-Gly對胃潰瘍大鼠的作用效果,結(jié)果顯示Ala-Gly可以使NF-κB p65失活發(fā)揮其抗炎作用,從而促進(jìn)胃潰瘍愈合。Cruzat等[30]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)毒素血癥小鼠口服Ala-Gln后,體內(nèi)的谷氨酰胺的利用度顯著增強(qiáng),證實(shí)Ala-Gln通過抑制NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。 2.2.3 神經(jīng)類活性 二肽可以作為神經(jīng)遞質(zhì)通過間接刺激腸道受體激素或酶的分泌而發(fā)揮作用。肌肽是一種組氨酸二肽,被認(rèn)為可能是嗅覺受體神經(jīng)元中的一種的神經(jīng)遞質(zhì)[31-32]。研究發(fā)現(xiàn),肌肽可以刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸,從而發(fā)揮類似興奮劑樣作用[33]。Tyr-Trp可以增強(qiáng)去甲腎上腺素的合成和代謝,并可以改善由β-淀粉樣肽(25~35)所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙[34]。此外,芳香二肽也具有神經(jīng)類活性,如Tyr-Arg、Tyr-Leu、Phe-Leu和Trp-Leu表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗焦慮活性[8,35-36]。Tyr-Arg還具有鎮(zhèn)痛作用[35],Tyr-Leu具有抗抑郁作用[37]。 2.2.4 降血壓活性 研究表明,從沙丁魚肌肉水解液中提取的二肽Val-Tyr、Val-Trp、Ile-Tyr和Ile-Trp均有降血壓作用[38-40]。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)[41],Val-Tyr主要通過抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶發(fā)揮降血壓作用。 2.2.5 降血脂活性 Aldini等[42]發(fā)現(xiàn)肌肽具有顯著降血脂活性,能夠降低肥胖Zucker大鼠的肥胖相關(guān)疾病(高血脂、高血壓、糖尿病和肥胖性腎病等)的發(fā)生。也有研究表明,人體補(bǔ)充含組氨酸的二肽(如肌肽)可以降低脂肪量,減少中心性肥胖[43],但是目前肌肽降脂機(jī)制尚不清楚。除肌肽外,Trp-Glu也被證實(shí)具有降脂作用,其可能機(jī)制是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-α增加細(xì)胞脂肪酸攝取,從而減少肝細(xì)胞中的肝脂積累[44]。 2.2.6 其他作用 除促細(xì)胞增殖、抗炎、神經(jīng)類活性、降血壓、降血脂外,二肽亦可發(fā)揮多種生物學(xué)功能。Matsui等[45]人研究發(fā)現(xiàn),載脂蛋白E基因敲除后動脈粥樣硬化小鼠口服Trp-His可有效減輕動脈粥樣硬化病變。Khedr等[46]報(bào)道,Trp-Leu可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子進(jìn)而抗血管生成。Nakato等[47]篩選了具有調(diào)節(jié)胃饑餓素釋放的二肽代謝物,發(fā)現(xiàn)Leu-Ile和Ser-Val分別表現(xiàn)出最強(qiáng)的胃饑餓素釋放抑制和刺激作用,并且Leu-Ile降低了小鼠的血漿胃饑餓素水平,Ser-Val增加了小鼠攝食量(見表1)。 圖片 3 二肽類代謝物的分析 目前用于二肽類代謝物分析的儀器方法有氫核磁共振(1H-NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等均被報(bào)道。LC-MS將液相色譜的高效分離特性和質(zhì)譜的強(qiáng)大定性和定量優(yōu)勢有機(jī)結(jié)合,是目前二肽類物質(zhì)分析中最有潛力且應(yīng)用最多的分析手段[48]。但由于二肽類代謝物結(jié)構(gòu)的特殊性,LC-MS在二肽類代謝物高靈敏、寬覆蓋檢測上仍面臨巨大挑戰(zhàn)。首先,二肽類代謝物濃度范圍廣(fmol·L-1~mmol·L-1)[1,13,49],一般質(zhì)譜的動態(tài)范圍難以滿足分析要求;其次,二肽類代謝物的組成單元中存在互為同分異構(gòu)體的氨基酸(亮氨酸與異亮氨酸),且氨基酸連接順序不同可產(chǎn)生順序異構(gòu)體,使得二肽在常規(guī)色譜柱上的分離難以實(shí)現(xiàn)。目前,基于LC-MS的二肽代謝物分析方法包括非靶向代謝組學(xué)、靶向代謝組學(xué)、化學(xué)衍生化輔助的靶向測定等。 3.1 二肽類代謝物的定性分析 隨著高特異性、高靈敏度質(zhì)譜的興起和各類離子源的快速發(fā)展,二肽的鑒定分析技術(shù)愈加成熟。但是二肽自身的質(zhì)譜信息較為簡單,難以產(chǎn)生豐度較高的定性碎片離子進(jìn)行無歧義結(jié)構(gòu)鑒定,因此研究者多借助化學(xué)衍生化來豐富二肽的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息。Madmon等[50]采用LC-ESI-MS/MS技術(shù)獲取二肽的[M+H]+、[M+Na]+以及二肽氨基甲酸酯衍生化之后的質(zhì)譜裂解信息,綜合多種碎片離子信息對二肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。Poliseli等[51]開發(fā)了一種5min快速LC-ESI-MS/MS分析方法,其基于二肽中羧基的中性丟失46Da,對乳清蛋白以及豬肝蛋白水解物中的二肽進(jìn)行鑒定,分別鑒定出18和14種二肽。Tang等[52]利用二甲基標(biāo)記和未標(biāo)記二肽的MS/MS圖譜比對,對二肽中氨基酸序列進(jìn)行識別,并建立二肽結(jié)構(gòu)預(yù)測的MS/MS圖譜數(shù)據(jù)庫。Li等[53]借助激光輔助化學(xué)轉(zhuǎn)移技術(shù)結(jié)合衍生化試劑4-羥基-3-甲氧基肉桂醛對組織中二肽化學(xué)衍生化后,使用MALDI-MS對組織中二肽進(jìn)行原位檢測分析,并應(yīng)用該策略對大鼠腦組織中34種二肽的空間分布進(jìn)行了表征。 3.2 二肽類代謝物的定量分析 二肽類代謝物定量分析方法按是否衍生化可分為兩大類:直接代謝組學(xué)分析和基于化學(xué)衍生化的靶向測定,而代謝組學(xué)分析中又包括非靶向和靶向兩種方法。 3.2.1 非靶向代謝組學(xué) 很多研究者利用非靶向代謝組學(xué)分析方法,在不同疾病模型中,發(fā)現(xiàn)了二肽類差異代謝物。Hou等[54]采用UPLC-IT-TOF/MS非靶向代謝組學(xué)方法,尋找腸道菌群介導(dǎo)的FOLFOX抗結(jié)腸癌療效個體差異的潛在生物標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)小鼠糞便樣本中Phe-Val、Leu-Gln、Ile-Ala在FOLFOX敏感和非敏感個體間存在顯著差異。Li等[5]對3482名志愿者血清樣本進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)Glu-Leu可作為結(jié)腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物。Vallianatou等[55]應(yīng)用UPLC-MS/MS對睡眠期間小鼠大腦的氨基酸及二肽進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,揭示晝夜節(jié)律與不同大腦區(qū)域特有的二肽代謝之間存在顯著相關(guān)性。 3.2.2 靶向代謝組學(xué) 在質(zhì)譜聯(lián)用法中可直接對生物樣本中的二肽進(jìn)行定量或半定量分析。然而二肽類代謝物一般極性較大,在反向色譜柱上難以保留,如果對其直接進(jìn)行LC/MS分離分析,一般會選用對極性化合物保留強(qiáng)的親水色譜柱或耐水型色譜柱。Ozawa等[1]建立LC-MS/MS和CE-MS/MS兩種分析方法應(yīng)用大于鼠肝臟中335種二肽的定量分析,兩種分析方法的結(jié)合可對二肽中的同分異構(gòu)體進(jìn)行有效分離并準(zhǔn)確定量。Nogimura等[25]用LC-MS/MS多重反應(yīng)監(jiān)測模式直接對血漿中Pro-Hyp和Hyp-Gly進(jìn)行了含量測定。 3.2.3 化學(xué)衍生化輔助的定量測定 二肽類代謝物一般極性較大,在反向色譜柱上分離困難,不易離子化,而且二肽結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜信息缺乏,難以產(chǎn)生穩(wěn)定的定量特征碎片離子。在此情況下,科研人員也嘗試將化學(xué)衍生化技術(shù)與LC/MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合,將強(qiáng)極性的二肽轉(zhuǎn)化為適于反相色譜分離并易于質(zhì)譜離子化的化合物。雖然引入化學(xué)衍生化使得分析流程復(fù)雜、耗時費(fèi)力且容易引入誤差,但對于復(fù)雜體系中的特殊性質(zhì)(如低豐度、難離子化、種類多、濃度范圍寬、無內(nèi)標(biāo)等)物質(zhì)的檢測往往能實(shí)現(xiàn)1+1>2的效果,可以極大提高常規(guī)LC/MS整體性能。經(jīng)化學(xué)衍生化之后的二肽色譜保留增強(qiáng)、離子化效率提高、定性定量碎片離子對信息豐富。目前,二肽的衍生化反應(yīng)主要是針對二肽中的氨基,衍生化試劑有丹磺酰氯(DNSCl)[6]、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯(AQC)[24,49]、三硝基苯磺酸(TNBS)[56]等。不同的衍生化試劑與二肽發(fā)生反應(yīng)的方程式分別如圖2所示。 圖片 4 結(jié)語與展望 二肽類物質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單、組成多樣、活性繁多,其生物學(xué)機(jī)制及與疾病的關(guān)聯(lián)值得深入研究。目前對于內(nèi)源性二肽代謝物研究還處于起步階段,對其種類、數(shù)量及產(chǎn)生過程認(rèn)識有限,文獻(xiàn)報(bào)道或數(shù)據(jù)庫收錄的代謝物較少且只有極少部分標(biāo)準(zhǔn)品可得,未知代謝物結(jié)構(gòu)難以有效鑒定,二肽類代謝物的高靈敏、寬覆蓋定量分析仍然面臨諸多挑戰(zhàn)。針對二肽類代謝物種類多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜、標(biāo)品來源受限的問題,可采用擬靶向代謝組[57]學(xué)和一測多評[58]的分析方法,實(shí)現(xiàn)基于有限標(biāo)品的寬覆蓋定量測定。針對該類代謝物離子化效率低、質(zhì)譜響應(yīng)差的問題,可利用化學(xué)衍生化實(shí)現(xiàn)高靈敏測定。未來針對該類物質(zhì)設(shè)計(jì)反應(yīng)效率高、衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性好、質(zhì)譜增敏效果好的衍生化試劑尤為重要。針對此類代謝物同分異構(gòu)體的分離分析難題,可考慮采用多維度(保留時間、離子淌度、特征碎片)整合分析方法,改善分離、提高鑒定可信度。隨著基礎(chǔ)研究和分析方法的快速發(fā)展,未知二肽代謝物的發(fā)現(xiàn),二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收、與受體之間的相互作用新機(jī)制,二肽在不同疾病中的關(guān)鍵作用發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證,將成為未來研究熱點(diǎn)。 免責(zé)聲明:本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí),版權(quán)歸原作者所有,如有侵權(quán),可聯(lián)系刪除 |
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