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細(xì)胞膜穿透肽促進(jìn)脂質(zhì)體包載的 siRΝΑ細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn) 、定位及其功能
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摘要 :目的 研究細(xì)胞膜穿透性寡肽-八聚精氨酸 (R8)輸送包載 siRNA 的脂質(zhì)體進(jìn)入細(xì)胞能力的促進(jìn)作用 。方法 將合成的 R8與 PEG-PE形成偶聯(lián)物并定向定量地插入包載 siR NA 脂質(zhì)體的外層膜上制成 R8-liposomal siR NA。熒光分光光度計(jì)測(cè)定脂質(zhì)體中 R8 的含量 ,熒光倒置顯微鏡觀察 R8 修飾的脂質(zhì)體與常用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000攜帶 siR NA對(duì)小細(xì)胞肺癌 NCI-H446的轉(zhuǎn)染效果 ,MTT法檢測(cè) R8-liposomalsiRNA 對(duì) NCI-H 446細(xì) 胞的生長(zhǎng)抑制作用 。結(jié)果 R8未修飾的脂質(zhì)體不能穿過(guò)細(xì)胞膜 ,而 R8修飾的脂質(zhì)體則能迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) ,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸定位在細(xì)胞漿和細(xì)胞核。R8修飾的脂質(zhì)體介導(dǎo) hdm2-siRNA 轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的效率和對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯強(qiáng)于 lipofectamine2000。結(jié)論 R8修飾的脂質(zhì)體可以有效輸送 siRNA 進(jìn)入細(xì)胞并增強(qiáng)其生物學(xué)功能 。 限制生物活性大分子藥物有效地發(fā)揮臨床效果的關(guān)鍵因素之一 ,就是不能穿過(guò)生物膜或細(xì)胞膜進(jìn) 入靶位與靶分子結(jié)合 ,或穿透性極低 。生物膜穿透性肽的發(fā)現(xiàn)為輸送生物活性大分子提供了一個(gè)新的有效手段 �；贖IV-1病毒TAT蛋白堿性氨基酸區(qū)域的TAT49 57的寡肽是一段核定位信號(hào)肽且具有似乎不依賴內(nèi)吞機(jī)制迅速穿透生物膜的功能 。利用 TAT49 57肽段已成功地將蛋白質(zhì) 、聚合物納米粒 、脂 質(zhì)體等輸送到各種類型的細(xì)胞內(nèi)和動(dòng)物的各個(gè)組織 器官[1 ~ 4] 。在 TAT49 57寡肽的基礎(chǔ)上 ,作者篩選出了比其穿膜能力更強(qiáng)的由 8 ~ 12個(gè)精氨酸組成的寡 聚體 。構(gòu)建了八聚精氨酸聯(lián)接的PEG化磷脂自組裝膠束 ,并實(shí)現(xiàn)了將其定量地插入到包載 hmd2 siRNA的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的脂雙層的外層膜上 。本文重點(diǎn)研究八聚精氨酸促進(jìn)siRNA細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn) 、定位及提高其穩(wěn)定性和生物活性的輸送載體的構(gòu)建及特性 。 材料與方法 藥品與試劑 蛋黃磷脂 (ePC ) 、膽固醇 (Ch) 、 二硬脂酰乙醇胺聚乙二醇 2 000(PEG2 000 -DSPE) 、二 棕櫚 酰 乙 醇 胺 ( DPPE ) 、二 油 酰 三 甲 胺 丙 烷 (DO TAP)和羅丹明標(biāo)記的二油酰乙醇胺 (Rho-PE) 購(gòu)自美國(guó) AvantiPolarLipids公司 ;三乙胺 、CL-4B瓊 脂糖和聚乙二醇 3 400二對(duì)硝基苯碳酸酯 ( PNP2 - PEG3 400 )均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司 ;21 bpsiRNA 由上 �；蛩幬锕� (ShanghaiGenePharma Co.)合成 , 有義鏈為 5/-GACUCGCAAC ACGC UAUUCTT-3/,并 于 3/端進(jìn)行熒光素 (FITC )標(biāo)記 ,反義鏈為 5/- GAAUAGC GUGUUGC GAGUC TT-3/; 八聚精氨酸(R8);基因轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine 2000(Invitrogen,USA );RPM I 1640培養(yǎng)基 (Gibco, 美國(guó) );優(yōu)質(zhì)胎牛血清 (北京圣瑪元亨生物有限公 司 );其他試劑均為分析純 。 細(xì)胞模型 小細(xì)胞肺癌 NCI-H 446 購(gòu)自美國(guó) ATCC 細(xì)胞庫(kù) 。細(xì)胞均在含 10% 胎牛血清的 RPM I 1640培養(yǎng)基中于 37 節(jié) ,5% CO2 的培養(yǎng)箱條件下連 續(xù)培養(yǎng) 。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞 。 儀器 zetasizer5000 (Malvern InstrumentsLtd) 激光衍射粒 度分析儀 ;數(shù) 碼 熒 光 倒置顯微鏡(Olympus1XT1和 Nikon D1數(shù)碼像機(jī) ,日本 );JEO L 透射電子顯微鏡 (日本 )。 pΝP-PΕG-DPPΕ 的合成[5] 取 20 mg. mL-1 DPPE氯仿溶液 10 mL,置 50 mL圓底燒瓶中 ,滴加 三乙胺 (TEA ) 0.65 mL,將 ( PNP)2 -PEG3 400 (200 mg. mL-1氯仿溶液 )約 4.0 g加入上述混合液中 , 吹入氮?dú)?,密封 ,避光 ,于室溫下 ,磁力攪拌過(guò)夜 。減 壓蒸干溶劑 ,真空除盡殘留氯仿 ,加入 0.01 mol. L-1 HCl水溶液 100 mL,超聲處理形成透明的膠束溶 液 。0.01 mol. L-1 HCl水溶液為洗脫液經(jīng) CL-4B Sepharose進(jìn)行分離 ,除去未反應(yīng)的 (PNP)2 -PEG3 400和釋放的 PNP,收集含 PNP-PEG-DPPE 膠束的洗脫 液 ,冷凍干燥 ,用 TLC , HPLC,MS 和 NMR 對(duì) PNP- PEG-DPPE進(jìn)行定性和定量檢查 。 R8-PΕG-DPPΕ 的合成[5] 取 PNP-PEG-DPPE 100 mg溶于氯仿 10 mL中 ,置 50 mL茄形燒瓶中 , 于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓除去氯仿 ,形成脂膜 ,真空除盡 殘留氯仿 ,將 R8 25 mg溶于 0.01 mol. L-1 HCl 4 mL中 ,加入內(nèi)壁涂布脂膜的茄形燒瓶中 ,于室溫 孵育 30 min,輕搖使脂膜充分分散 。于混懸液中加 10 mmol. L-1 (pH 9.0) Tris緩沖液 20 mL,混勻 ,氮?dú)獗Ｗo(hù) ,于 4 節(jié) 孵育過(guò)夜 。將樣品置分子質(zhì)量為 5 kD的透析袋中 ,在 10 mmol. L-1 (pH 7.4) Tris緩 沖液中透析約 4 h,再用去離子水于 4 節(jié) 透析 24 h, 取出袋內(nèi)溶液 ,冷凍干燥 ,置 -20 節(jié) 冰箱內(nèi)保存 。 脂質(zhì)體的制備[5] 將 ePC ,Ch, PEG2 000 -DSPE 和 DO TAP的氯仿溶液按摩爾比 (60:34:3.0:3.0) 混合 ,如需標(biāo)記脂膜 ,于上述混合液中加入占總脂質(zhì) 量摩爾比為 0.1% Rho-PE,減壓除盡氯仿 ,形成脂 膜 。將一定量的 siR NA溶于經(jīng) DEPC 處理的超純水 中 ,siR NA 用量應(yīng)完全中和 DO TAP所帶的正電荷 。于 50 節(jié) 水浴中 ,用含 siR NA 的水溶液將上述磷脂 膜水化 30 min形成包裹 siR NA 的脂質(zhì)體 。用手動(dòng) 擠出裝置 (AvantiPolarLipids)將初步形成的脂質(zhì)體 分別過(guò) 0.4μm 和 0.1 μm 的聚碳 酸酯核孔 膜 (Whatman) 10次 ,制備粒徑均一的脂質(zhì)體 。適量 R8-PEG-DPPE溶于甲醇中 ,置圓底燒瓶 ,氮?dú)獯蹈?成膜 ,加入制備好的脂質(zhì)體混懸液 ,于 37 節(jié) 水浴中 , 溫浴 2 h使 R8-PEG-DPPE 定向地插入到脂質(zhì)體的 外層膜上 。其中八聚精氨酸在脂質(zhì)體中占總脂質(zhì)成 分的摩爾比一般為 0.5% ~ 1.0% ,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可 適當(dāng)調(diào)整其比例 。用動(dòng)態(tài)激光散射 、冰凍蝕刻電子 顯微鏡 、核酸電泳來(lái)檢驗(yàn)八聚精氨酸修飾的包載 siR NA的聚乙二醇修飾的脂質(zhì)體的理化特性 。 膠束和脂質(zhì)體中八聚精氨酸的定量測(cè)定[6] 精密稱定 R8和 R8與 PEG2DPPE 的偶聯(lián)物溶于或 分散于純水中使 R8的質(zhì)量濃度范圍為 5 ~ 50 μg. mL-1 。取樣品 20 μL置 25 mL量瓶中 ,加入 2 μg. mL-1 9,102菲醌熒光衍生化試劑 (9,102菲醌溶于二 甲基甲酰胺 ,新鮮配制 ,4 節(jié) 可保存 1周 ) 2.5 mL和 1 mol. L-1 NaOH 溶液 0.25 mL,室溫放置 45 min, 加入 1 mol. L-1 HCl溶液 0.25 mL,用水定容至刻 度 ,樣品進(jìn)行熒光掃描 。按上述方法將 R8修飾的 脂質(zhì)體 (R82liposomes)與 9,102菲醌熒光衍生試劑反 應(yīng)后進(jìn)行熒光掃描 。 八聚精氨酸介導(dǎo)的脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和分布 NCI2H 446細(xì)胞按每孔細(xì)胞數(shù)為 8.0 x 103接種 96孔 板中 ,培養(yǎng)過(guò)夜 ,洗去培養(yǎng)基 ,分別加入5 μL的下列 樣品 :Rho2PE 標(biāo)記的 R82liposomes, Rho2PE 標(biāo)記的 liposomes,R8修飾的包載 FITC 標(biāo)記的 siR NA 脂質(zhì) 體 (R82liposomal FITC2siR NA ), lipofectamine 20002 FITC2siR NA 復(fù)合物 (lipofectamine 20002FITC2siR NA complex),每一樣品 3復(fù)孔 。除 lipofectamine 20002 FITC2siR NA complex加入不含血清的培養(yǎng)基外 ,每 孔中加入含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基 100 μL,再于 37 節(jié) ,5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 1,3,6和 24 h。于各設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取出細(xì)胞 ,用滅菌 PBS溶液洗 3 遍 ,置熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并用 Nikon D1數(shù) 碼相機(jī)拍攝照片 。 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) NCI2H 446細(xì)胞按每孔細(xì) 胞數(shù)為 8.0 x 103接種 96孔板中 ,培養(yǎng)過(guò)夜 ,洗去培 養(yǎng)基 ,分別加入不同脂質(zhì)濃度的下列樣品各 5 μL: R82liposomes和 lipofectamine 2000以及不同 siRNA濃度的列樣品各5μ L: R82liposomal siRNA, lipofectamine 20002siR NA, lipofectamine 20002siR NA complex,每一樣品 3 復(fù)孔 。除 lipofectamine 20002 siR NA complex加入不含血清的培養(yǎng)基外 ,每孔中加 入含 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基 100 μL,于 37 節(jié) ,5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24 和 48 h。于各設(shè)定時(shí) 間點(diǎn)取出細(xì)胞 ,每孔加入 MTT 20 μL(5 mg. mL-1 ), 再培養(yǎng) 4 h,每孔加入 DM SO 150 μL溶解 ,置于酶標(biāo) 儀 ,在 590 nm處檢測(cè)其最大吸收 ,繪制各濃度組的 生長(zhǎng)曲線 。 結(jié)果 1 R8與pΝP2PΕG 2DPPΕ偶聯(lián)物的合成 當(dāng)溶液的 pH> 8時(shí) ,PNP2PEG2DPPE 與 R8的 氨基末端反應(yīng)形成穩(wěn)定的氨甲酸酯鍵 ,同時(shí)釋放出 游離的對(duì)硝基苯。PEG2DPPE在水中自動(dòng)形成 10 ~ 15 nm 膠束 ,由于它是雙親性分子 ,當(dāng) R8與 PEG2 DPPE形成偶聯(lián)物后 ,增加了 R82PEG2DPPE 分子中 親水端的相對(duì)分子質(zhì)量使其形成的膠束的水化半徑 更大 。因此 ,PEG2DPPE偶聯(lián) R8后 ,在分子篩柱上 的保留行為發(fā)生較大的變化 (圖 1)。PNP2PEG2 DPPE和 R82PEG2DPPE在 HPLC 分子篩柱上的保留 時(shí)間分別為 9.0 min(圖 1A)和 7.8 min(圖 1B)。當(dāng) R8與 PNP2PEG2DPPE在 4節(jié)反應(yīng)24h后 ,樣品直 接進(jìn)行 HPLC 檢測(cè) ,在色譜圖中得到保留時(shí)間分別 為 9.0 min和 7.8 min的兩個(gè)峰 (圖 1C ),說(shuō)明 R8與 PNP2PEG2DPPE發(fā)生了偶聯(lián) 。反應(yīng)混合物置于相對(duì) 分子質(zhì)量為 5 000的透析袋中 ,分別在 Tris緩沖液 和水中經(jīng)一定時(shí)間的透析 (24 h)可以將未結(jié)合的 R8,PEG2DPPE和釋放的 PNP完全除去 (圖 1B)。 圖片 2 膠束和脂質(zhì)體中八聚精氨酸的含量 為了定量地評(píng)價(jià) R8介導(dǎo)的脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)輸送 能力 ,建立精確地測(cè)定插入到脂質(zhì)體外層膜上R8的含量是十分必要的。由于R8本身不具有發(fā)色基團(tuán) ,不能用一般的光譜方法直接檢測(cè) 。利用 R8分 子中的胍基能專屬性地與一些有機(jī)化合物的基團(tuán)反 應(yīng)產(chǎn)生熒光的性質(zhì) ,將 R8在堿性條件下與 9,10-菲 醌反應(yīng)產(chǎn)生具有熒光的 R8-菲醌偶合物 。R8, R8- PEG-DPPE與 9,10-菲醌反應(yīng)后 ,產(chǎn)物分別進(jìn)行熒光 掃描 ,結(jié)果見圖 2A 和圖 2B。R8,R8-PEG-DPPE 與 9,10-菲醌反應(yīng)后產(chǎn)物具有相同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射 波長(zhǎng) ,二者均為 260 nm 和 405 nm 。然而 ,R8-PEG- DPPE所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度比 R8產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度稍 強(qiáng) 。未經(jīng) R8修飾的脂質(zhì)體與 9,10-菲醌反應(yīng)不產(chǎn) 生熒光 (圖 2C ),這一結(jié)果提示 R8脂質(zhì)體中脂質(zhì)成 分并不影響 R8的測(cè)定 。以 R8-PEG-DPPE 的濃度 對(duì)熒光強(qiáng)度回歸 ,得標(biāo)準(zhǔn)曲線 :F = 363.570C(μg.mL-1 ) - 15.493, = 0.999 8。線性范圍 0.2 ~ 20μg. mL-1 。樣品測(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)為 260 nm和發(fā)射 波長(zhǎng)為 405 nm。R8-liposomalsiRNA 經(jīng)十二烷基磺 酸鈉 (SDS)裂解并與 9,10-菲醌反應(yīng)后測(cè)定其熒光 強(qiáng)度 ,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脂質(zhì)體中 R8-PEG-DPPE 的 含量 。脂質(zhì)體中 R8的摩爾分?jǐn)?shù)為 0.52% 。由于已知脂質(zhì)體中 R8 和磷脂的用量 ,對(duì)于一個(gè)給定粒徑 的單室脂質(zhì)體 ,即可以定量計(jì)算每個(gè)脂質(zhì)體上所攜 帶 R8的數(shù)量[7] 。本文所用脂質(zhì)體的粒徑為 150 nm,每個(gè)脂質(zhì)體上所攜帶 R8的分子數(shù)量約為 300 ~ 500個(gè) 。 圖片 3 脂質(zhì)體的特性 為了克服核酸類藥物在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)普遍存在的 易被核酸酶迅速降解而導(dǎo)致的不穩(wěn)定性和半衰期 短 、不能透過(guò)細(xì)胞膜和組織分布的非特異性等問(wèn)題 , 本研究設(shè)計(jì)了基于以下3個(gè)功能的基因藥物轉(zhuǎn)導(dǎo)載 體 :電荷中和及其誘導(dǎo)的自組裝 、PEG 分子形成的 保護(hù)外殼和暴露于脂質(zhì)體外層表面的細(xì)胞膜穿透肽，動(dòng)態(tài)散射光測(cè)定結(jié)果明 , liposomal-siRNA和R8-liposomalsiRNA粒徑分布窄而均一 ,平均粒徑分 別為 133 nm和 138 nm, liposomal-siR NA 經(jīng) R8修飾 后平均粒徑增大了約 5 nm 。冰凍蝕刻電子顯微鏡 照片 顯 示 , R8-liposomal siRNA 的外形構(gòu)造類似SARS病毒 ,其大小在 50 ~ 200 nm,由數(shù)個(gè)15 ~ 30 nm的小顆粒組裝而成 (圖 3A )。凝膠電泳顯示 , siR NA 的雙鏈不能被溴化乙錠染色 ,表面活性劑十二烷基磺酸鈉處理后 ,siRNA 被釋放出來(lái)并能被溴 化乙錠染成明亮的條帶 (紫外燈下 ),其條帶在凝膠上的位置與游離 siR NA 的條帶一致 (圖 3B) 。另 外 ,脂質(zhì)體包裹的 siR NA 在血清中的穩(wěn)定性顯著增加 ,與血清共溫育 24 h后未見分解。相反,游離的 siR NA在 6 h內(nèi)被完全分解 。 圖片 4 體外細(xì)胞攝取 4. 1 R8促進(jìn)脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及其胞漿的累積小細(xì)胞肺癌 NCI-H446細(xì)胞分別用羅丹明標(biāo)記的R8修飾的脂質(zhì)體或羅丹明標(biāo)記的 R8未修飾的脂質(zhì)體 處理不同時(shí)間 ,結(jié)果見圖4。脂質(zhì)體經(jīng) R8修飾后顯 著地促進(jìn)了脂質(zhì)體向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。1h后 ,在細(xì)胞 內(nèi)可觀察到明顯的熒光 ,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng) (3 ~ 6 h),胞漿內(nèi)的熒光強(qiáng)度增高并逐漸向核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn) 。未經(jīng)R8修飾的脂質(zhì)體則不能進(jìn)入細(xì)胞 ,甚至細(xì)胞被 處理24h,也未觀察到熒光。R8介導(dǎo)的脂質(zhì)體細(xì)胞 內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)存在明顯的溫度依賴性 ,當(dāng)用羅丹明來(lái)標(biāo)記的R8修飾的脂質(zhì)體在4ε處理細(xì)胞不同時(shí)間 ,僅在 胞膜上觀察到熒光 ,延長(zhǎng)孵育時(shí)間胞膜上的熒光增強(qiáng)。上述結(jié)果說(shuō)明 ,R8可促進(jìn)脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和 在胞漿的累積 。 圖片 4. 2 R8介導(dǎo)脂質(zhì)體包裹的hdm2 -siRΝΑ轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞熒光標(biāo)記 siRNA并將其包裹于R8修飾的脂質(zhì)體中 ,考察 R8輸送 siR NA 穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞 的能力 。小細(xì)胞肺癌 NCI-H446細(xì)胞分別用 R8-liposomal FITC-siR NA 和 lipofectamine 2000-FITC- siRNA complex處理不同時(shí)間 ,結(jié)果見圖5。R8-liposomalFITC-siR NA在 10% 血清存在的培養(yǎng)基中 其轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力比 lipofectamine2000-FITC-siRNAcomplex在無(wú)血清的培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染能力強(qiáng) (比較經(jīng)二者處理的細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度 )。Lipofectamine 2000-FITC-siRNAcomplex在有血清的培養(yǎng)基中不 能轉(zhuǎn)染細(xì)胞或轉(zhuǎn)染率極低 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明 ,血清的存在不影響 R8介導(dǎo)轉(zhuǎn)染效率 。 圖片 5 Ηdm2-siRΝΑ細(xì)胞毒作用 P53顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡而抑制腫瘤的生 長(zhǎng)是腫瘤生成的抑制基因 。大多數(shù)人腫瘤細(xì)胞高表 達(dá) HDM2 蛋白 ,HDM2 蛋白的高表達(dá)加速細(xì)胞內(nèi) P53的降解和抑制 P53的活性 ,促進(jìn)了腫瘤的生成 和生長(zhǎng)。因此 ,P53及其相關(guān)調(diào)控基因可作為抗腫 瘤藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)的新靶標(biāo)。根據(jù) RNAi理論 ,作 者設(shè)計(jì)合成了選擇性地降解 hdm2 mRNA 的 siR NA片段。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)表明 , R8-liposomal siR NA在 10%血清存在的培養(yǎng)基中其抑制腫瘤細(xì) 胞生長(zhǎng)的能力比 lipofectamine 2000-siR NA complex 在無(wú)血清的培養(yǎng)基中的抑制效果稍強(qiáng) ,抑制百分率分別為71.5%和57%(圖 6)。Lipofectamine2000- siRNA complex在有血清的培養(yǎng)基中不能有效抑制 細(xì)胞的生長(zhǎng) ,故在實(shí)驗(yàn)中采用常用的無(wú)血清轉(zhuǎn)染 。 圖片 討論 近年來(lái) ,小分子干擾 RNA (siR NA )能高效且特 異地阻斷內(nèi)源性同源基因的表達(dá)即 RNA 干涉 (RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) ,一方面拓展了 RNA 在基因表 達(dá)調(diào)控中生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí) ;另一方面 ,作為一種簡(jiǎn) 便而又高效特異的抑制靶基因表達(dá)的新技術(shù) ,RNA干涉在新基因的功能研究以及抗病毒和抗腫瘤治療 新措施的探索中也廣為應(yīng)用[8-10]。與反義核酸相 比 ,siRNA具有選擇性強(qiáng) 、毒性低的優(yōu)點(diǎn) ,這是因?yàn)?siR NA只高度特異性地降解同源性靶標(biāo) mRNA,不 影響其他基因 mRNA 的表達(dá)或影響較小。另外 ,兩 者作用于靶基因的不同周期和靶基因在細(xì)胞內(nèi)的不同位置 ,反義核酸是在核內(nèi)與前體 mRNA 結(jié)合而發(fā) 揮作用 ,siRNA則是在胞漿內(nèi)與成熟的 mRNA 結(jié)合 而使其降解。由于 siR NA 的作用靶點(diǎn)必須定位于 胞漿 ,而且 , siR NA 與其他用于基因治療的核酸類藥物一樣 (DNA 和 RNA )普遍存在著體內(nèi)穩(wěn)定性 差、生物利用度低和不能穿過(guò)由脂雙層構(gòu)筑的細(xì)胞 膜等問(wèn)題。因此 ,有效地將核酸類基因藥物輸送到 靶組織細(xì)胞內(nèi)是了解核酸類基因藥物作用機(jī)制和生 物學(xué)功能的關(guān)鍵 ,基因藥物輸送載體的研究成為基因治療中研究的重點(diǎn)。為解決上述問(wèn)題 ,作者成功 地構(gòu)建了基于長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的細(xì)胞膜穿透性肽修飾的非病毒的基因或基因藥物的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。小細(xì)胞肺 癌細(xì)胞株體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)顯示八聚精氨酸修飾的脂質(zhì) 體介導(dǎo) hdm2-siRNA的轉(zhuǎn)染效率顯著高于目前廣泛使用的基因轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000,而毒性明顯低于 lipofectamine 2000,并實(shí)現(xiàn)了靶基因的沉默 和對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 。 免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除 |
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tzynew3樓
2023-06-14 15:30
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2023-06-15 21:14
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XG-WUST5樓
2023-06-17 15:08
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nono20096樓
2023-06-17 17:27
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專注多肽(金幣+1): 謝謝參與
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