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yexuqing木蟲之王 (文學泰斗)
太陽系系主任
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中國科大在基因敲入供體的優(yōu)化方面取得新進展
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中國科大在基因敲入供體的優(yōu)化方面取得新進展 中國科學技術大學合肥微尺度物質(zhì)科學國家研究中心、化學與材料科學學院梁好均教授與生命科學與醫(yī)學部鮑堅強研究員合作，針對目前基因敲入供體的低效率、高成本等問題，優(yōu)化并提出了一種新型的功能核酸供體，極大地提高了基因敲入的效率。研究成果以“Efficient precise integration of large DNA sequences with 3′-overhang dsDNA donors using CRISPR/Cas9”為題，于5月22日通過直投方式（DirectSubmission）發(fā)表在國際學術期刊美國科學院院刊《PNAS》上。 CRISPR技術改變了我們操縱基因組進行研究和基因治療的能力，使用帶有同源臂的外源供體作為模板依賴同源介導修復（HDR）途徑來精確敲入基因。然而，對于基因大小的DNA供體模板，HDR途徑十分低效。目前，可采用在ssDNA或dsDNA供體末端引入化學修飾以增強供體穩(wěn)定性，供體共價連接到CRISPR系統(tǒng)上提高切割位點局部濃度等方法提高基因敲入效率。但是，這些方法具有操作困難，成本高等問題。所以，迫切需要進一步優(yōu)化基因敲入的供體，以促進CRISPR/Cas9介導的基因大小的敲入在生命科學和臨床治療中的應用。 圖1（A）ssDNA供體基因敲入的機理；（B）dsDNA供體基因敲入的機理；（C）odsDNA的結構；（D）odsDNA供體基因敲入的機理。 鑒于此，梁好均教授課題組深入調(diào)研ssDNA和dsDNA作為供體的敲入機理，結合課題組在核酸化學領域的經(jīng)驗，在單個供體中整合ssDNA和dsDNA的獨特優(yōu)勢，設計并提出了一種具有3′懸突的dsDNA結構（odsDNA），并將其作為供體實現(xiàn)CRISPR/Cas9介導的大片段基因敲入（LOCK）。 圖2 odsDNA的合成示意圖及用于基因敲入的三種方法。 本項工作是梁好均教授課題組繼dsDNA供體5′末端化學修飾提高基因敲入效率（Nat. Chem. Biol., 2020, 16, 387–390）和RNA介導的CRISPR-dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)（J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 12690–12697）之后，基因編輯方向又一重大突破。該研究提出了一種經(jīng)濟普適的方法來制備任意3′懸突長度的odsDNA供體，利用鏈中帶有連續(xù)五個硫代磷酸酯（phosphorothioate）修飾的引物通過PCR擴增目的基因序列，再通過Lambda核酸外切酶消化處理，得到具有3′懸突的odsDNA。通過比較基因大�。�1.1kb和2.5kb）的DNA供體的敲入效率，發(fā)現(xiàn)odsDNA顯著提高了靶向精確敲入效率，與通用的dsDNA供體相比最高可提高4.3倍，同時在許多哺乳動物細胞跨多個基因組位點中保持了較低的插入缺失率和脫靶事件。當利用3′單鏈懸臂與偶聯(lián)技術結合時，使用odsDNA供體的敲入效率比dsDNA供體提高5.2倍。該LOCK策略在基因敲入中具有顯著優(yōu)勢，在未來有望取代ssDNA或dsDNA供體，實現(xiàn)其他策略無法完成的大片段基因敲入。 中國科學技術大學合肥微尺度物質(zhì)科學國家研究中心博士研究生韓汶杰為該論文第一作者。中國科學技術大學合肥微尺度物質(zhì)科學國家研究中心、化學與材料科學學院梁好均教授和生命科學與醫(yī)學部鮑堅強研究員為該論文通訊作者。該項研究得到科技部和國家自然科學基金委等項目的支持。 論文鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2221127120 （合肥微尺度物質(zhì)科學國家研究中心、化學與材料科學學院、生命科學與醫(yī)學部、科研部） |
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