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細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色實(shí)驗(yàn)方法！
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一、目的 ⒈學(xué)習(xí)微生物涂片和染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌簡(jiǎn)單染色法； �、矊W(xué)習(xí)無(wú)菌操作，并鞏固顯微鏡的使用方法； ⒊學(xué)習(xí)在油鏡下觀察細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)。 二、原理 由于細(xì)菌體積小、菌體透明，活體細(xì)胞內(nèi)含有大量水分，且對(duì)光線的吸收和反射與周?chē)尘皼](méi)有顯著的明暗差，因而很難在普通光學(xué)顯微鏡下觀察它們的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。只有經(jīng)過(guò)染色，借助顏色的反襯作用才可看清菌體形態(tài)以及菌體表面結(jié)構(gòu)。染色技術(shù)是觀察微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要手段。 能夠使微生物著色的化合物被稱(chēng)為染色劑，染色劑一般都是成鹽化合物。目前普遍采用的微生物染色劑多為苯的衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中除含有苯環(huán)外，還連接有發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)。發(fā)色團(tuán)可使化合物顯色，而助色團(tuán)則能增加色度，并因具有電離特性，可與菌體細(xì)胞相結(jié)合，從而使其著色。 含有酸性助色團(tuán)（如羥基-OH）的染色劑稱(chēng)為酸性染色劑，其電離后分子帶負(fù)電，可與鈉、鉀、鈣、氨等離子結(jié)合，多用于細(xì)胞質(zhì)的染色，如酸性品紅、剛果紅等。含有堿性助色團(tuán)（如氨基-NH2）的染色劑稱(chēng)為堿性染色劑，其電離后分子帶正電，主要用于細(xì)胞核和異染粒等酸性細(xì)胞結(jié)構(gòu)的染色。由于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中布滿(mǎn)核物質(zhì)和異染粒等結(jié)構(gòu)，因此細(xì)菌染色一般采用堿性染色劑，通常包括氯化物、硫酸鹽、醋酸鹽或草酸鹽等。 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色，即只利用一種染色劑使菌體著色。此法操作簡(jiǎn)單，適用于細(xì)菌形態(tài)的觀察。通常細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色也采用堿性染色劑，如結(jié)晶紫或堿性品紅等，堿性染料不是堿而是一種鹽，電離時(shí)染料離子通常帶正電荷。而在中性、堿性或弱酸性的溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶有負(fù)電荷，這樣帶正電荷的染料離子就容易與帶負(fù)電荷的菌體細(xì)胞相結(jié)合并使其著色。染色后便于觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小和排列方式等特征。 三、材料 ⒈菌種：大腸桿菌（Esecherichia coli） 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ⒉染料：草酸銨結(jié)晶紫染液。 �、称渌狠d玻片，無(wú)菌水，洗瓶，擦鏡紙，吸水紙，二甲苯或無(wú)水乙醚：無(wú)水乙醇（3：1）混合液，香柏油及接種用具。 四、方法 (一)細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色 �、蓖科涸跐崈舻妮d玻片中央滴1 小滴無(wú)菌水，用無(wú)菌接種環(huán)（火焰滅菌）挑取少量大腸桿菌或金黃色葡萄球菌分別與無(wú)菌水充分混合，涂成極薄的菌膜；（注意：菌量不宜過(guò)多，否則菌體堆積成塊不易看清個(gè)體形態(tài)�。� �、补潭ǎ菏謭�(zhí)玻片一端，將有菌膜的一面朝上，通過(guò)微火3-4 次，使水分蒸干；（注意：可用手背接觸涂片反面，以不燙手為宜。否則過(guò)分烘烤會(huì)導(dǎo)致菌體變形�。� �、橙旧簩⒉Ｆ糜诓Ｆ苌�，待其冷卻后，在涂片部位滴加適量（蓋滿(mǎn)菌膜）的草酸銨結(jié)晶紫染液，染色1 分鐘； �、此矗簝A去染液，用普通蒸餾水自玻片一端輕輕沖洗，至流下的水中無(wú)染液的顏色為止。 ⒌干燥：用吸水紙吸去多余水分；（注意：勿擦去菌體�。� �、剁R檢：在低倍鏡下找到視野后，轉(zhuǎn)換油鏡觀察，繪制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌形態(tài)圖； �、非謇恚簩�(shí)驗(yàn)完畢后，清潔油鏡頭，整理顯微鏡使其復(fù)原并在記錄本上登記。將染色片放入含有5%苯酚的廢片缸中。 (二)油鏡的使用和清理 �、庇顽R的使用： �。�1）在低倍鏡下找到鏡檢部位后，用粗螺旋將鏡筒提升約2 厘米，將油鏡轉(zhuǎn)置鏡筒正下方； �。�2）在鏡檢部位滴上1 滴香柏油； �。�3）從側(cè)面注視，用粗螺旋將鏡筒小心降下，使油鏡侵入香柏油中，讓鏡頭幾乎與標(biāo)本相接；（注意：不要用力過(guò)猛以免壓碎玻片損壞鏡頭！） �。�4）從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光線使其明亮，再調(diào)節(jié)細(xì)螺旋使鏡筒緩慢提升，直至視野內(nèi)出現(xiàn)清晰物象為止。 �、灿顽R的清理： 觀察完畢，提升鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，接著用另一張擦鏡紙蘸少許二甲苯擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈擦鏡紙?jiān)俨潦脙杀橐猿埩舻亩妆健Ｍ科幭惆赜偷奶幚砼c此相同。（注意：不要過(guò)量使用二甲苯，以免其殘留在鏡頭上影響觀察�。� 五、結(jié)果 分別繪出油鏡下大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的形態(tài)圖，注明放大倍數(shù)，并描述它們的排列方式。 |
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