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peptide.鐵蟲 (初入文壇)
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[交流]
芋螺肽的分支GⅢA簡單合成介紹
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1.1 GⅢ A-1 的化學結構及合成路線 GⅢA-1 的氨基酸序列為 Arg-Asp-Ala-Cys-Thr-Hyp-Hyp-Lys-Lys- Cys- Lys-Asp-Arg -Gln-Ala-Lys-Hyp-Gln-Arg-Cys-Cys-Ala*（*表示 C-端酰胺化） ， 含有兩個鏈內二硫鍵 Cys 4 -Cys 20 ， Cys 10 -Cys 21 ） 。 其合成路線如圖1 1.2 GⅢA-1 樹脂肽的合成（固相合成） （1） 樹脂肽的合成 采用 Fmoc 保護策略固相合成 GⅢA-1 樹脂肽。 反應在 CEM Liberty 微波輔助全自動多肽合成儀上進行， 反應條件為微波功率 35W， 反應溫度 75℃。 樹脂采用取代度為 0.74 mmol/g 的聚苯乙烯基 Rink Amide AM 樹脂， 以 20%哌啶/DMF 溶液作為脫保護劑， 肽鍵形成采用 HBTU 偶聯(lián)， 反應物按樹脂載量 5 倍摩爾數(shù)投料。合 成 過 程 中 各 側 鏈 保 護 的 氨 基 酸 分 別 選 用 Fmoc-Arg(Pbf)-OH ，F(xiàn)moc-Asp(OBu t )-OH， Fmoc-Cys(Acm)-OH， Fmoc-Ala-OH， Fmoc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Thr(Bu t )-OH， Fmoc-D-Pro-OH， Fmoc-Lys(Boc)-OH， Fmoc-Gln(Trt)-OH， „„。多肽鏈構建完成后， 脫除 N-端氨基酸的 Fmoc 保護基。 （2） 樹脂多肽的獲得 樹脂肽收縮， 從多肽合成儀上取下， 加入 DCM 使之懸浮， 用真空泵抽濾， 加入DCM 洗滌 4-5 次， 再用真空泵抽干， 稱重。 1.3 GⅢA-1-a 的合成（合成和純化線肽） （1） 裂解 將 1.31 g 樹脂肽置于圓口燒瓶中， 攪拌下緩緩加入 30 mL 裂解液（TFA： Tis：水=95： 2.5： 2.5， V/V， 每克肽樹脂需加裂解液 12-15 mL） 進行裂解， 室溫下電磁攪拌反應 1.5 h； （2） 粗肽的獲得 裂解液過濾， 濾液減壓除去 TFA， 用冷的無水乙醚沉淀出粗肽。 將粗肽轉入離心管中， 離心， 棄去上清液， 沉淀物用冷的無水乙醚洗滌 3 次（重復離心過程） ，將所得粗肽在離心管中晾干， 稱重； （3） 粗肽的分析 取 0.20 mg粗肽溶于 0.1% TFA/水， 溶解后離心， 取上清液約 50 μ L進樣 HPLC分析， 流動相為 A， B 二元梯度， A 為 0.1% TFA/水， B 為 0.1% TFA/乙腈， 60.0 min內 B 從 0%變?yōu)?60%， 流速 1 mL/min， 檢測波長為 214 nm； （4） 質譜鑒定 收集 HPLC 主要產物， 用 MALDI-TOF-MS 分析。 （5） 線肽的純化 取粗肽 120 mg 溶于約 15 mL 0.1% TFA/水， 0.22μ m 針頭過濾器過濾， 濾液進樣過 HPLC 半制備柱， 每次進樣量約 8 mg（進樣量逐步放大） ， 流速為 3 mL/min的， 然后梯度洗脫， 流動相為 A， B 二元梯度， A 為 0.1% TFA/水， B 為 0.1% TFA/乙腈， 40.0 min 內 B 從 0%變?yōu)?40%， 檢測波長為 214、 254 和 280 nm； （6） 線肽的冷凍干燥 收集 HPLC 目標組分， 收集液用旋轉蒸發(fā)儀減壓除去乙腈， 冷凍干燥過夜，稱重， 取少量溶于 0.1% TFA/水（濃度 1 mg/mL） 用 HPLC 分析純度， 其余放置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?得到線肽 40 mg， 產率 33.3%。 1.4 GⅢA-1-b 的合成（空氣氧化） （1） 線肽的氧化 稱取 30 mg GⅢA-1-a， 以 0.2 mg/mL 的濃度溶入 150 mL 0.2 M 碳酸氫銨水溶液， 電磁攪拌， 室溫條件下反應； （2） 氧化監(jiān)測 每 24 h 取約 50 μ L 氧化液進行 HPLC 分析， 通過觀察出峰時間、 峰形變化判斷氧化反應是否完全， 同時輔以 MALDI-TOF-MS 檢測； （3） HPLC 制備 轉化完成后， 氧化液用 0.22 μ m 針頭過濾器過濾， 以 5 mL/min 的流速通過C18 制備柱， 然后梯度洗脫， 洗脫梯度為 55.0 min 內 B 從 0%變?yōu)?55%， 檢測波長為 214、 254 和 280 nm， 用自動收集器收集； （4） 單環(huán)肽 GⅢA-1-b 的獲得 MALDI-TOF-MS 分析確定目標組分所在管， 收集， 減壓除去收集液中的乙腈，冷凍干燥， 稱重， 取少量溶于 0.1% TFA/水（濃度 1 mg/mL） 進行 HPLC 分析純度，其余放置于 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br /> 1.5 GⅢA-1 的合成（碘氧化） （1） 單環(huán)肽的碘氧化 稱取 30.0 mg GⅢA-1-b 溶于 10 mL 反應溶劑（水： 乙腈： TFA=6： 3： 1， V/V）中， 加入 3 mL 碘/乙腈溶液（5 mg/mL） ， 使溶液保持發(fā)黃的狀態(tài)； （2） 反應的終止 攪拌反應 30 min 后， 加入抗壞血酸水溶液（5 mg/mL） ， 混勻， 使溶液呈無色澄清， 減壓除去乙腈； （3） 分析制備 取樣 HPLC 分析， 收集主要產物， MALDI-TOF-MS 分析。 確定目標產物峰后，反應液經(jīng) HPLC 半制備柱制備， 收集目標產物， 減壓除去多余乙腈， 冷凍干燥，稱重， 取少量溶于 0.1% TFA/水（濃度 1 mg/mL） 用 HPLC 分析純度， 其余放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br /> 2.1 結果與討論 2.1.1 GⅢ A-1 樹脂肽的合成（固相合成） 反應完成后， 取下樹脂肽， 經(jīng) DCM 洗滌、 抽干后， 稱重 1.6 g。 2.1.2 GⅢ A-1-a 的合成（合成和純化線肽） 1.6 g 樹脂肽經(jīng)裂解、 沉淀、 洗滌后得粗肽 500 mg， 理論產量 600 mg， 產率83%。 粗肽用 HPLC 分析(圖 2.3)， 收集主峰峰尖并進行 MALDI-TOF-MS 分析確定目標峰位置。 150 mg 粗肽用 HPLC 制備得到線肽 GⅢA-1-a 60 mg， 產率 40%。 線肽用 HPLC分析（圖3） ， 收集主峰峰尖并進行 MALDI-TOF-MS 分析， 單同位素峰為 2692.4（圖 4） ， 與計算值 2692.2 相符。 2.1.3 GⅢ A-1-b 的合成（空氣氧化） 30 mg 線肽經(jīng)空氣氧化過夜后， 取 50μ L 進行 HPLC 分析（圖 5） ， 分析表明原料已經(jīng)基本消失， 收集主峰峰尖， 進行 MALDI-TOF-MS 分析確定。 氧化反應用制備柱純化， 得到 20 mg GⅢA-1-b， 理論產量 30 mg， 產率 66%。 單環(huán)肽用 HPLC分析（如圖 6） ， 并進行 MALDI-TOF-MS 分析， 單同位素峰為 2690.6(圖 6)，與計算值 2690.7 相符。 2.1.4 GⅢ A-1 的合成（碘氧化） 單環(huán)肽經(jīng)碘氧化 30 min 后， HPLC 分析表明， 存在兩個峰， 收集主要產物，MALDI-TOF-MS 分析確定目標產物峰后， 反應液經(jīng) HPLC 半制備柱純化， 得到 12mg GⅢA-1， 理論產量 20 mg， 產率 60%。 目標肽用 HPLC 分析（圖7） ， 收集主峰峰尖并進行 MALDI-TOF-MS 分析， 單同位素峰為 2546.1（圖8） ， 與計算值相符 2546.1。 2.1.5 討論 本章主要通過 Fmoc 固相多肽合成法完成了 GⅢA 的合成。 在合成的過程中主要得到以下經(jīng)驗： （1） GⅢA 是天然產物， 直接采用空氣氧化法即可獲得正確配對的產物合成中， 緩沖溶液的選擇會影響其合成產率。 本論文中根據(jù)實驗室經(jīng)驗選用胱氨酸-半胱氨酸-乙酸銨氧化體系， 獲得了滿意的產率。 （2） 在含兩個二硫鍵的衍生物合成中， 線肽、 單環(huán)肽的制備都比較順利， 但是單環(huán)肽碘氧化形成目 標肽時， 遇到了困難， 主要體現(xiàn)為部分肽的碘氧化反應不夠徹底（HPLC 分析為兩個大小接近的雙峰） 、 產率低， 分析認為影響碘氧化的因素包括溫度、 反應時間、 碘的用量， 而且每個肽的情形也不相同， 有的肽碘氧化迅速、 徹底， 但是有的肽轉化很慢且產率很低， 需要進行預實驗摸索條件。 （3） 構建兩個二硫鍵時， 除了先進行空氣氧化純化得到單環(huán)肽再進行碘氧化外， 還可用“一鍋法” ， 即在空氣氧化后， 用 TFA 將溶液調節(jié)為酸性， 直接進行碘氧化。 但是， 利用“一鍋法” 合成不同的肽可能有不同的效果， 比如利用該法成功制得了 GⅢA-2， 但是制備 GⅢA-3 時目標肽發(fā)生丟失， 可能與不同肽的親水性有關。 （ 4） 在含一個二硫鍵多肽的合成中， 由于空氣氧化時線肽濃度較低（ 0.2mg/mL） ， 為方便進樣制備， 先旋蒸除去大量水， 一般剩余 50 mL 左右。 在 GⅢA-2,3 的首次合成中， 旋蒸時幾乎將氧化液蒸干， 加入 0.1% TFA/水溶解后進行制備， 發(fā)現(xiàn)目標肽丟失。 重復該過程有相同結果。 分析原因應該是隨著水不斷減少，NH4 HCO 3 濃度不斷加大， 使得溶液 pH（0.2 M NH4 HCO 3 溶液 pH 為 8.76） 上升，導致了多肽的水解。 因此， 除水過程應先將 pH 調至酸性。 1.png 2.png 3.png 4.png 5.png 6.png 7.png 8.png |
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