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28968058wj新蟲 (小有名氣)
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為什么高爾基染色法只能鍍?nèi)景俜种宓纳窠?jīng)元，還被認為是很神奇的結(jié)果？
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為什么高爾基染色法只能鍍?nèi)景俜种宓纳窠?jīng)元，還被認為是很神奇的結(jié)果？ 高爾基染色法第一次揭示了完整的神經(jīng)元結(jié)構，并且恰恰是因為這種方法只能染一小部分神經(jīng)元，才讓人們可以清晰地看到神經(jīng)元的結(jié)構以及這些神經(jīng)元之間的聯(lián)系。 原理： 用重鉻酸鉀和鉻酸鉀，氯化汞作為初步固定劑浸潤組織，鉻鹽和神經(jīng)細胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合，氯化汞通過白色沉淀來標記單個細胞，進一步經(jīng)過堿處理，使沉淀物變黑(硫化汞)。該法最顯著的特點是其反應終產(chǎn)物都局限于單個神經(jīng)細胞的內(nèi)部，而其周圍去多類似的神經(jīng)細胞不著色，從外觀上看，就好像從固定到脫水的全過程在細胞膜水平都存在一個阻止可見產(chǎn)物擴散的屏障。 01 明膠玻片的制備 高爾基染色的腦片較厚，如果使用普通玻片貼片，在染色過程中，腦片很容易從玻片上脫落下來，影響實驗結(jié)果，對此需制備特殊明膠包被載玻片，以供高爾基染色使用。 方法： 加熱500mL雙蒸水，后加入10g明膠，攪拌溶解。待溶解后加入0.5g硫酸鉻鉀，攪拌溶解(此步驟需在通風櫥內(nèi)進行)，定容至1L，過濾冷卻至室溫。將干凈的玻片浸入溶液當中，避免氣泡形成。37°C烤干玻片，烤干后4°C保存。 02 腦組織標本收集 1、在取腦前24小時提前等量混合AB液，并不能攪拌。制備好的浸泡液在用之前室溫黑暗保存可長達一個月。每cm3待研究組織至少用5ml浸泡液。注意用較少的浸泡液可能降低染色的靈敏性和可靠性。 2、殺死動物之前對實驗動物進行深度麻醉。應盡快地從顱骨中取出動物的腦(或死去病人的腦)，但操作時必須非常小心以免損傷或壓迫組織。 3、用雙蒸水快速沖掉組織表面的血液，把組織浸泡在由溶液A和B等體積混合的浸漬液中，室溫下黑暗保存兩周。浸泡6個小時以后或次日更換新的浸漬液。 4、轉(zhuǎn)移組織到溶液C中室溫黑暗至少72小時 (可長達1周)。24小時后或次日至少更換一次溶液。 03 冰凍切片 1、從C溶液中去除組織，擦除表面液體，置于-24°C切片機中的樣本盤上滴加雙蒸水包被冰凍。 2、使用修塊(Trim)模式進行切片，切片厚度100-150um，按實際需要調(diào)整切片溫度。 3、在寫好標記的載玻片上滴一滴C液，可用毛筆涂開。用玻璃分針把樣本轉(zhuǎn)移到玻片上，使之在C液中展開，注意腦片與載玻片中間不能留有氣泡。載玻片上多余的溶液用吸管吸走并用濾紙吸干(載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻片上脫落下來)。切片可以室溫下自然風干(不能用電風扇或電熱板使其干燥)。為取得最佳結(jié)果，應盡快地完成切片，制備好的切片如果保存于載玻片盒中，室溫黑暗條件下最長可保存3天。 04 高爾基染色 在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干。 1、用雙蒸水沖洗切片兩次，每次4分鐘。 2、堿化： 把切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份的雙蒸水組成的混合液中10分鐘。比如:溶液D10ml溶液E 10ml雙蒸水 20ml。 注意： 切片的工作液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，每100mI工作液最多用于100張切片(比如小鼠腦)。盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發(fā)。為取得最佳結(jié)果，孵育期間應頻繁攪拌工作液。 3、用蒸水沖洗切片兩次，每次4分鐘 (蒸留水應頻繁更換新的)。 4、在50%，75%和95%的乙醇中對切片進行脫水，每個濃度梯度脫水4分鐘 (不要跳過任何一個步驟)。 5、然后在無水乙醇中對切片進行脫水，4次，每次4分鐘(不要延長時間)。 6、在二甲苯中誘明，3次，每次4分鐘，并且用樹脂封片劑對蓋玻片進行封片。 7、避光晾干，拍照進行數(shù)據(jù)分析。。 |
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