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滲透性腹瀉動物模型的建立方法~
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在我國，慢性腹瀉是嬰幼兒發(fā)病率很高的疾病，6個月至2歲的嬰幼兒發(fā)病率最高，1歲以內約占50%，對兒童的生長發(fā)育及健康危害極大，已成為世界公共性衛(wèi)生問題。慢性腹瀉病因復雜，包括過敏、感染、免疫缺陷、酶缺陷、藥物及先天畸形等，以急性感染性腹瀉未徹底治療、遷延不愈最為常見。從病理生理學角度，慢性腹瀉病還可細分為滲透性腹瀉、分泌性腹瀉、動力障礙性腹瀉和炎癥性腹瀉，其中滲透性腹瀉在兒童中相對常見。 本次小助手講解兩種滲透性腹瀉模型的構建方法，分別是檸檬酸鎂腹瀉（Mg）組以及乳糖腹瀉（Lac）組。 造模方法 選取SD大鼠，體質量300g左右，雌雄各半。Lac組以高乳糖飼料喂養(yǎng)，飲用水采用滅菌純凈水；Mg組以基礎飼料喂養(yǎng)，同時以檸檬酸鎂溶液代替滅菌純凈水飲用；Con組（正常組）以基礎飼料和滅菌純凈水喂養(yǎng)。所有實驗大鼠均自由進食和飲水。喂養(yǎng)15d，建立相應慢性腹瀉模型。 腹瀉情況觀察 所有實驗大鼠均以單籠飼養(yǎng)，籠底墊鐵架，每日同一時間進行體重、飲水量測量和大便觀察。觀察大便的性狀、顏色。對每只大鼠每天的稀便、干便進行計數(shù)，用分規(guī)和刻度尺測量每一稀便污跡的直徑。以腹瀉率和腹瀉指數(shù)作為評判腹瀉的主要指標。腹瀉指數(shù)＝稀便率×平均稀便級。稀便率＝每只動物所排的稀便數(shù)÷該動物總便數(shù)。稀便級表示每只動物稀便的程度，以稀便的直徑分級，分為4級：＜1cm為1級，1～1.9cm為2級，2～3cm為3級，＞3cm為4級。平均稀便級＝所有稀便級數(shù)／稀便數(shù)。腹瀉率（％）＝腹瀉的動物數(shù)／該組動物總數(shù)×100％。 抓力和自主活動度測試 抓力測試： 將腹瀉14d后的大鼠置于抓力測試儀上，當它在被人為牽拉尾部向后移動時會本能地抓住測試儀上的鐵架以克服后退，當外界對其施加的拉力超過其自身的最大抓力時會被拉離抓力測試儀的鐵架，此時，儀器會自動記錄抓力的最大值。每一只大鼠重復上述操作5次，每次測試之間讓其休息5s，取5次抓力的平均值。 自主活動度測試： 測試前讓大鼠在進行實驗的房間適應半天。測試開始時把大鼠放置于曠場實驗箱中央?yún)^(qū)，通過動物行為分析系統(tǒng)觀察和分析其在曠場試驗箱內的活動情況，每只大鼠測試10min，觀察指標包括運動總路程和運動平均速度。測試均在下午1時到下午4時之間進行。每次測試結束后，將大鼠放回籠內，清洗曠場實驗箱底部和側壁，噴灑少量75％乙醇，待曠場試驗箱干燥無異味后方可進行下一只動物的測試，每只大鼠測量1次。 跨腸上皮電阻測試 取2cm長結腸中段，將腸腔內黏液和腸內容物用PBS溶液輕柔漂洗凈，避免損傷腸黏膜，然后將該段腸組織安裝在尤斯灌流室中的ussing chamber內固定，膜兩側注入飽和的37℃Krebs液10ｍＬ（Krebs液：NaCl13.67ｇ、NaHCO3 4.2g和葡萄糖3.96g用雙蒸水1500mL溶解，加入STOCK液 100mL定容至 2000mL， 4 ℃ 保存。STOCK液的配制：CaCl2 5.56ｇ、KCl7.01ｇ、MgCl2·6H2O 4.88ｇ 和 NaH2PO4·2H2O 3.74g用雙蒸水900mL溶解，定容至1000mL，4℃保存），并且分別在灌流室兩側勻速通入5％CO2和95％Ｏ2組成的混合氣體，開始進行腸黏膜跨腸上皮電阻檢測，每個樣本測試時間為1h。對每個樣本50～60min區(qū)間段的電阻值進行積分，取同組大鼠腸黏膜跨腸上皮電阻平均值。 腸黏膜形態(tài)學的觀察 剖腹，取2cm小腸下段，2cm結腸中段。用4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，用光鏡觀察腸黏膜病理學改變。每個實驗組取4張不連續(xù)切片，每張切片隨機選取5個垂直、完整的絨毛，應用圖像分析系統(tǒng)測量絨毛高度和絨毛表面積（r為絨毛的半徑，h為絨毛的高度，單位以mm表示）。上述腸黏膜觀察與腸絨毛測量均在光鏡放大100倍下進行。 總結 由腹瀉導致的新生兒死亡率高達 17％，對發(fā)展中國家5歲以下兒童的生命造成嚴重威脅，全球每年死于腹瀉病的兒童約有200萬。腹瀉根據(jù)病程可分為急性腹瀉和慢性腹瀉，臨床上將腹瀉時間超過2周的統(tǒng)稱為慢性腹瀉。在我國，隨著生活環(huán)境的改善、生活水平的提高，急性腹瀉�。ㄌ貏e是急性重癥腹瀉）有所減少，但慢性腹瀉患兒比例卻有上升趨勢。國內有學者調查表明嬰幼兒遷延性、持續(xù)性腹瀉約占腹瀉病的 62.6％。因此，研究慢性腹瀉的發(fā)病機制、藥物療效、營養(yǎng)支持等具有較高的臨床價值。 |
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