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jiamywsw新蟲 (初入文壇)
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求助GFP標(biāo)記失敗原因
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做gfp標(biāo)記細(xì)菌，但是做了好久都沒標(biāo)記上，選用的質(zhì)粒有pgfp4412、pht01-p43gfpmut3a兩種，所需標(biāo)記的菌株是一株鞘氨醇單胞菌，都沒轉(zhuǎn)化成功，在此請求哪位大神指點一下，感激不盡~ 具體操作如下： 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用的細(xì)胞原種 1. 取菌液甘油保存-80°c。 2. 用接種環(huán)直接將凍存的菌種在r2a瓊脂平板表面劃線，在 23°c培養(yǎng)16h。 （沒有必要融化凍存的細(xì)菌。當(dāng)接種環(huán)在凍存菌種表面上劃過時，將附著足量的細(xì)胞。一管凍存菌種可以使用很多次。如果培養(yǎng)箱不能設(shè)定到23c，可以在室溫下孵育r2a平板） 3. 將4或5個分開的菌落轉(zhuǎn)移到含2ml r2a液體培養(yǎng)基的新的干凈的15ml培養(yǎng)管中，23°c培養(yǎng) 16h。（菌落直徑應(yīng)該不超過2~3mm。可根據(jù)需要設(shè)置多個2ml培養(yǎng)物） 4. 在每份培養(yǎng)物中，添加無菌甘油至終濃度為 15%(v/v)。 5. 分裝到2.5ml 凍存管中，每管 1ml。將凍存管裝入到一個塑料密封袋中，浸入干冰/乙醇浴中5min。 6. 將塑料袋及其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到-80°c冰箱。 感受態(tài)細(xì)胞的制備 7. 將1ml小管里的原種細(xì)胞接種到r2a液體培養(yǎng)基，20°c培養(yǎng)約8h，測定其在 600nm的光密度，od600值達(dá)到0.3-0.4時，停止培養(yǎng)。 8. 當(dāng)培養(yǎng)物的od600值達(dá)到0.4 時，快速地將培養(yǎng)管轉(zhuǎn)移到冰水浴中 15~30min。不時地旋動培養(yǎng)物以保證均勻冷卻。在準(zhǔn)備用于下一步驟時，將離心管放到冰水浴中。 （為了獲得最大的轉(zhuǎn)化效率，確保在本方案中任何階段細(xì)菌的溫度都不高于 4°c是至關(guān)重要的） 9. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到2 ml 預(yù)冷的無菌離心管中。4°c，1800rpm離心 15min，收集細(xì)胞。輕輕倒出上清。 10. 用2ml冰冷的超純水重懸細(xì)胞沉淀，輕輕地上下吹打，4°c，1500rpm離心20min，收集細(xì)胞。輕輕棄去上清。 11. 重復(fù)上述步驟 12. 將細(xì)胞沉淀重懸于 1ml冰冷的 10%甘油（超純水配置）中。4°c， 1500rpm離心20min，收集細(xì)胞。輕輕棄去上清。（棄倒上清時要小心，因為在 10%甘油中細(xì)菌沉淀的附著力會降低） 13. 將細(xì)胞沉淀重懸于 1ml 冰冷的10%甘油中。輕輕地上下吹打混合，4°c，1500rpm離心20min，收集細(xì)胞。（當(dāng)離心機(jī)停止時，馬上小心地倒出上清液，去除所有剩余的緩沖液液滴。） 14. 將沉淀重懸于100μl 冰冷的 10%甘油中，-80°c冰箱保存（最好的做法是輕輕地旋動，而不是吹吸或漩渦振蕩） 電擊轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 15. 在冰上融化100μl 感受態(tài)細(xì)胞，加入8ul的質(zhì)粒。輕輕混合管子，冰上預(yù)冷10 min后 16. 轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電擊杯（0.1cm）中；將裝有混合液的電擊杯冰中預(yù)冷 5 min 后電擊轉(zhuǎn)化 17. 打開電轉(zhuǎn)儀，調(diào)至manual，(200 歐姆， 25μfd，1.7千伏)；轉(zhuǎn)化時間隨 dna 樣品的不同而變化，并由儀器自動給出，一般在 3.5～6.0 ms 范圍內(nèi); 18. 將電擊杯插入電擊槽中，將電極杯推入電轉(zhuǎn)化儀，按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，檢查時間常數(shù)t(time const.)按扭，時間常數(shù)應(yīng)在4以上。 19. 迅速向電擊杯中加入400μl r2a液體培養(yǎng)基（28℃預(yù)熱），輕緩地重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至2 ml 離心管中，28 ℃，180 rpm搖床復(fù)蘇2 h，同時以未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞作為對照。 20. 取搖床復(fù)蘇2 h的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物200μl涂布于含有相應(yīng)抗生素的r2a固體培養(yǎng)基上，放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)48 h，查看轉(zhuǎn)化結(jié)果。 21. 其余菌液按1：1的比例加入30％的甘油后混勻-80℃保存。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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鐵蟲 (小有名氣)
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