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RGD修飾紫杉醇脂質體的制備及其肺癌靶向治療研究
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作者：魏小棟，中國醫(yī)院藥學雜志 目的:制備 RGD修飾載紫杉醇(paclitaxel,PTx)脂質體(RGDLP-PTx),研究其理化性質,并探究其肺癌靶向治療作 用 。方法:采用薄膜分散法制備 RGDLP-PTx。 熒光分光光度法研究A549細胞和NCI-H46細胞對普通脂質體(LP)和 RGD 修飾脂質體(RGDLP)的攝取效率 。噻唑藍實驗研究不同紫杉醇濃度對 A549細胞和 NCI-H46細胞的細胞毒性;流式細胞儀 檢測 RGDLP-PTx對 A549細胞和 NCI-H46細胞的凋亡誘導作用。用 A549細胞構建肺癌裸鼠異位腫瘤模型,研究 RG- DLP-PTx的體內抗腫瘤作用 。結果:RGDLP-PTx的粒徑為(106.3土 15.2)nm,電位為(6.23土 2.2)mV;A549細胞對 RG- DLP-PTx的攝取效率是 LP-PTx的4.4倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);NCI-H46細胞對 RGDLP-PTx的攝取效率是 LP- PTx的3.8倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);RGDLP-PTx對 A549細胞和 NCI-H46細胞的增殖抑制率具有濃度依賴性;在 相同紫杉醇濃度下,RGDLP-PTx對 A549細胞和 NCI-H46細胞的增殖抑制率顯著強于LP-PTx和游離紫杉醇,差異有統(tǒng)計 學意義(P<0.01);RGDLP-PTx,LP-PTx和游離紫杉醇誘導肺癌 A549細胞的凋亡率分別為48.3%,27.4%和35.5%,與生 理鹽水組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);NCI-H46 細胞凋亡率分別為41.3%,22.8%和34.1%,與生理鹽水組比較,差 異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。RGDLP-PTx,LP-PTx和游離紫杉醇對肺癌腫瘤的抑制率分別為69.3%,47.5%和24.4%,差 異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結論:RGD修飾載紫杉醇脂質體能夠高效抑制肺癌細胞的增殖和腫瘤的生長,是一種有效的肺 癌靶向給藥系統(tǒng)。 肺癌是當前嚴重威脅人類健康的疾病 。當前肺 癌的治療主要以手術為主 ,輔以放療和化療[1-2·,化 療藥物的全身分布對患者正常的組織產(chǎn)生嚴重的毒 副作用 。近年來 ,研究具有腫瘤靶向性的藥物成為 了抗腫瘤研究領域的熱點[3·。有報道顯示 ,肺癌細胞表面有大量的整合素受體表達[4-6·,RGD與整合 素受體具有特異親和力 ,能夠與整合素受體特異性 結合 ,因此 RGD可以連接到納米載體表面用于腫 瘤靶向研究[7-9·。本研究將整合素受體特異性配體 RGD連接到脂質體表面 ,以紫杉醇為模型藥物 ,研究 RGD修飾的紫杉醇脂質體的體內外肺癌靶向治 療作用。 1 材料 BALB/c裸鼠購自武漢大學實驗動物中心 ,雄 性 ,8周齡 ,體質量19~20g,飼養(yǎng)于SPF級動物房 , 許可證號:WD2013-082;A549肺癌細胞和 NCI- H46細胞購自美國 ATCC細胞庫;紫杉醇(江蘇恒 瑞藥業(yè) ,批號 130011);1640培養(yǎng)基(維森特生物有 限公司);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物科技公 司);0.25%胰酶(Gibco公司);大豆磷脂(SPC,美國 Sigma公司); DSPE-PEG2000、FITC標記磷脂、DSPE-PEG2000- MAL(美國 Avantipolarlipids)。 2 方法 2.1 RGD修飾紫杉醇脂質體(RGDLP-PTx)的制備 參照文獻[10]合成 RGD-PEG2000-DSPE。簡言之 ,將 DSPE-PEG2000-Mal用適量氯仿溶于茄形瓶中 ,旋轉蒸發(fā)除去溶劑成膜 ,真空干燥過夜 。加入適量 PBS緩沖液(pH 7.4)水化 1 h(37℃ ,200r· min-1),水浴超聲5 min使形成均勻 的 DSPE- PEG2000-Mal膠束溶液 。將 cRGDfK多肽溶于適 量 PBS緩沖液中 ,加人 DSPE-PEG2000-Mal膠束溶液 ,N2保護下 4 ℃攪拌反應直至 TLC薄層色譜(展開劑 MeOH  CM=1:10)鑒定 DSPE-PEG-Mal 點基本消失 。得 DSPE-PEG2000-RGD。參照文獻 [11]使用薄膜分散-超聲法制備 ,將處方量的 SPC, Cho,DSPE-PEG-RGD,DSPE-PEG-OMe,FITC-PE[保證總磷脂:膽固醇=65:35(摩爾比)]和紫杉醇分 別溶于氯仿 ,置茄形瓶中抽干成膜 。加人2.5 ml PBS緩沖液(pH 7.4),置空氣浴搖床中 ,37℃ ,180 r·min-1 ,振搖 20min后 ,探頭超聲(80W ,5 s,15 次)制備得到 RGDLP-PTx。用相同量的 DSPE- PEG-OMe取代DSPE-PEG-RGD 制備得到 LP- PTx.取制備得到的脂質體用 SizerNanoZS90型激 光粒度儀及 ZETA電位分析儀測定其粒徑和電位 。取適量脂質體采用冷凍超速離心機離心30min后 , 取上清液用甲醇破乳 ,用 HPLC法在 227nm檢測 紫杉醇包封率 。DiamonsilC18 色譜柱(200mmx 4.6 mm,5 以m);流動相:乙腈-水(50:50);檢測波長:227nm;柱溫:35℃;流速:1ml·min-1 ;進樣量: 20以l。包封率% =M上清液 /M投藥量x100% 。取適量 RGDLP-PTx鈾負染后于透射電鏡下觀察其形態(tài)。2.2 細胞攝取試驗 將 A549細胞和 NCI-H46 細胞以 1x 105個的密度分別接種于24孔板內 ,用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng) 48h,移去培養(yǎng)基 ,分別加人FITC標記的 RGDLP-PTx和 LP-PTx,加培養(yǎng)基 調整脂質體的終濃度 。37℃孵育 60min后 ,棄去 脂質體懸液 ,將細胞用冷PBS漂洗 3次 ,洗去吸附在細胞表面的脂質體 。每孔加人 1ml1%Triton溶液于37℃孵育 20min以裂解細胞 。吹打混勻后 , 吸取 100以l留樣 ,余下 900以l稀釋至3 ml后 ,用熒光分光光度法(Ex =488nm,Em =525nm)測定其 熒光強度。 2.3 細胞毒性試驗 取生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生 長期的 A549細胞和 NCI-H46細胞 ,以細胞密度 1x104個接種于96孔培養(yǎng)板中 ,在 37℃、5% CO2及飽 和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,待細胞完全 貼壁后 ,觀察細胞融合度在80%左右且細胞形態(tài)飽 滿后 ,棄去培養(yǎng)基 ,加人 RGDLP-PTx,LP-PTx和游 離紫杉醇樣品 ,用新鮮不含血清的基礎培養(yǎng)基調節(jié)阿 霉素由低至高分別為0.3,3,10,20,30以g·ml-1溶液 。共同孵育 24h后棄去供試懸液 ,加人新鮮培養(yǎng)基繼 續(xù)培養(yǎng)24h后 ,棄去培養(yǎng)基 ,每孔加人20以l的 5mg· ml-1 MTT的 PBS溶液(pH7.4)及180以l新鮮不含 血清培養(yǎng)基補足體積 ,在微量振蕩器上振蕩 3 min,將 培養(yǎng)板移人培養(yǎng)箱 ,繼續(xù)孵育 4 h之后 ,移去培養(yǎng)基 , 每孔加人20以l的 DMSO,37℃振搖孵育 15min,然 后在 570nm處 ,用酶標儀測定各孔的吸光度(A值)。每組設置3個復孔。 2.4 細胞凋亡誘導試驗 A549細胞和NCI-H46 細胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng) ,用 0.125%胰酶消化成單細胞懸液后計數(shù) ,按 2x 105 個/孔的密度接種于直徑為 35mm 的圓形培養(yǎng)皿中 ,在 37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng) 24h, 待細胞完全貼壁生長后 ,更換孔內培養(yǎng)基 ,每個細胞孔加人 4 ml新鮮含血清培養(yǎng)基 ,再加人 20 以l的 RGDLP-PTx,LP-PTx和游離紫杉醇 ,將培養(yǎng)皿置于 37℃ ,5% CO2條件下孵育 4 h后 ,吸出孔板內液 體 ,PBS洗2遍 ,每孔加人 6 000以l新鮮培養(yǎng)基 ,繼 續(xù)培養(yǎng) 96h后 ,進行凋亡測定。 2.5 肺癌移植瘤的構建 A549荷瘤裸鼠模型的建立參照文獻進行 ,將 8周齡的雄性 BALB/c裸鼠用 8%水合氯醛麻醉(腹腔注射 ,40mg·kg-1)后 ,將 A549細胞消化后離心 ,PBS洗2遍 ,將細胞重懸于無 血清的新鮮 1640培養(yǎng)基中 ,之后按每只 1x106個細 胞(10以l)的量 ,皮下注射接種于 BALB/c鼠背部 ,12 ~14d后 ,背部腫瘤直徑達到 10~14mm,可用于后 續(xù)試驗 。在第3,6,9,12天進行尾靜脈給藥。 3 結果 3.1 RGDLP-PTx的表征 制備得到的 RGDLP-PTx的粒徑為(106.3土 15.2)nm,電位為(6.23土 2.2)mV。紫杉醇的包封率為(86.73土8.4)% 。見 表 1。投射電鏡觀察 RGDLP-PTx如圖 1所示 ,脂 質體呈球形 ,均一性良好。 3.2 細胞攝取試驗 細胞攝取試驗結果顯示 , A549細胞對 RGDLP-PTx的攝取效率是 LP-PTx 的4.4倍 ,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)。NCI- H46細胞對 RGDLP-PTx的攝取效率是 LP-PTx 的3.8倍 ,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖 2。 3.3 細胞毒性試驗 MTT試驗結果如圖 3所示 , RGDLP-PTx對 A549細胞和 NCI-H46細胞的增 殖抑制率隨著紫杉醇濃度的增加而增強 。在相同紫 杉醇濃度下 ,RGDLP-PTx對 A549細胞和 NCI- H46細胞的增殖抑制率顯著強于 LP-PTx和游離 紫杉醇(P<0.01)。 3.4 細胞凋亡試驗 細胞凋亡試驗結果如圖 4所 示 ,RGDLP-PTx、LP-PTx和游離紫杉醇誘導肺癌 A549細 胞 的 凋 亡 率 分 別 為 48.3% ,27.4% 和 35.5% ,與生理鹽水組比較 ,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);GDLP-PTx對 A549細胞的凋亡率與 LP- PTx和游離紫杉醇比較 ,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01);NCI-H46 細 胞 凋 亡 率 分 別 為 41.3% , 22.8%和34.1% ,與生理鹽水組比較 ,差異有統(tǒng)計學 意義(P<0.01);RGDLP-PTx 對 NCI-H46 細胞 的凋亡率與 LP-PTx和游離紫杉醇比較 ,差異有統(tǒng) 計學意義(P<0.01)。 3.5 腫瘤生長抑制試驗 不同紫杉醇對 A549荷 瘤裸鼠腫瘤的生長抑制試驗結果如表 2所示 ,RG- DLP-PTx,LP-PTx和游離紫杉醇對肺癌腫瘤的抑 制率分別為 (69.3 土 3.23)% ,( 47.5 土 2.16)%和 (24.4土1.45)% ,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 4 討論 紫杉醇是目前臨床上常用的細胞毒性化療藥 物 ,已經(jīng)被用于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、頭頸部腫 瘤和非小細胞肺癌的治療[12]。然而由于其毒副作 用導致其臨床應用受到了一定的限制 。隨著納米技 術的發(fā)展 ,脂質體、納米粒和聚合物膠束被用于包載 抗腫瘤藥物 ,利用腫瘤組織的 EPR(enhancedper- meabilityandretentionefect)效應到達腫瘤組織 , 進人腫瘤組織發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。脂質體由于其 良好的生物相容性被廣泛研究 。在脂質體表面連接 具有腫瘤靶向性的多肽或受體能夠增強脂質體進人 腫瘤細胞的能力 。整合素是一類細胞黏附受體分 子 ,在所有的有核細胞表面均廣泛表達 ,其在體內能 夠介導細胞與細胞之間 ,以及細胞與細胞外基質的 相互黏附[14]。整合素是由 a和 β亞基通過非共價 鍵結合形成的異二聚體 ,其中整合素 avβ3在神經(jīng)膠 質瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多種腫瘤細胞及腫瘤相關 的內皮細胞表面高度表達 ,與腫瘤的血管發(fā)生 ,腫瘤 轉移及腫瘤的抗放射治療密切相關 ,因此整合素 avβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點[15-16]。 已有 研究表明 ,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)的三肽序列能夠特異性地識別含 av亞基的 整合素家族 ,進一步的研究也已證實 ,具環(huán)狀結構的 RGD能夠顯示出和整合素 avβ3、avβ5的高度親和 力 ,其與整合素 avβ3的親和力約為線性 RGD 的 1 000倍[17]。本研究將整合素受體的特異性配體 RGD肽連接到脂質體表面 ,對其肺癌靶向性和肺癌 細胞增殖抑制能力進行研究。 本研究采用薄膜分散法制備 RGD修飾的紫杉 醇脂質體 。脂質體的粒徑約 100nm,能夠有效地利 用腫瘤組織的 EPR效應到達腫瘤組織 ,再利用腫瘤 組織表面的整合素受體介導脂質體進人腫瘤細胞內 部 。體外細胞攝取試驗結果證實 A549細胞和 NCI-H46細胞對 RGD修飾的紫杉醇脂質體的攝 取效率都被增強 。 細胞毒性試驗結果證實 ,RG- DLP-PTx對 A549細胞和 NCI-H46 細胞的增殖 抑制能力顯著強于其他 LP-PTx和游離紫杉醇。在研究中 ,我們發(fā)現(xiàn)游離紫杉醇溶液對肺癌細胞的 增殖抑制能力強于 LP-PTx,這是由于紫杉醇是難 溶性藥物 ,必須用乙醇和蓖麻油混合溶液配制 ,其溶 劑毒性較大 ,導致細胞實驗過程中產(chǎn)生了比 LP- PTx更強的細胞毒性 。在體內腫瘤生長抑制試驗 中 ,LP-PTx對荷瘤裸鼠腫瘤生長抑制能力強于游 離紫杉醇 ,這與體外細胞增殖抑制實驗結果不一致 , 這是由于 LP-PTx能夠通過 EPR效應蓄積到腫瘤 組織 ,發(fā)揮抗腫瘤作用 。經(jīng)過 RGD修飾的紫杉醇 脂質體能夠增強紫杉醇抗腫瘤生長作用 。綜上所 述 ,RGD修飾的紫杉醇脂質體能夠有效抑制肺癌細 胞增殖 ,并誘導肺癌細胞凋亡和抑制荷瘤裸鼠腫瘤 的生長 ,是一種有效的肺癌靶向給藥系統(tǒng)。 免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權歸原作者所有，如有侵權，可聯(lián)系刪除。 |
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