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[交流]
基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽的研究進(jìn)展
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作者：黃佳明，姜寧，張愛忠，10.13344/j.microbiol.china.180687 摘 要： 目前，利用基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽，提供有效和穩(wěn)定的方法是抗菌肽生產(chǎn)的熱點(diǎn)之一。了解抗菌肽工程菌表達(dá)系統(tǒng)、生產(chǎn)量尤為重要，為此本文闡述了抗菌肽的生產(chǎn)方式，介紹了基因工程菌表達(dá)系統(tǒng)的種類、組成及特點(diǎn)，分析了基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽的主要困難因素，并對近些年利用基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽的進(jìn)展進(jìn)行了綜述。 自第一個(gè)抗菌肽——天蠶素被發(fā)現(xiàn)以來[1]，迄今為止，已發(fā)現(xiàn) 2 400 多種抗菌肽[2]�？咕耐ǔＪ怯啥贪被嵝蛄袠�(gòu)成的小肽，具有廣譜的殺菌活性[3]，對病毒和癌癥細(xì)胞[4]都有一定的殺傷能力，除此之外還具有一定的免疫學(xué)活力。由于抗生素弊端的不斷顯現(xiàn)，使得抗菌肽也越來越多地作為一種潛在的抗生素替代物而被人熟知，抗菌肽的生產(chǎn)也受到廣泛關(guān)注。如何獲得大量具有更好抗菌活性的抗菌肽一直都是抗菌肽開發(fā)生產(chǎn)的主要內(nèi)容。越來越多的研究表明，相比于傳統(tǒng)的分離法和化學(xué)合成法，采用基因工程技術(shù)是開發(fā)、生產(chǎn)抗菌肽的有效方法。一方面，經(jīng)過基因工程技術(shù)得到的抗菌肽，可以作為產(chǎn)品進(jìn)行鑒定和開發(fā)；另一方面，與其他的方法相比，基因工程法存在著可以大規(guī)模生產(chǎn)、成本低等潛在優(yōu)勢。并且近些年分子生物學(xué)和DNA 重組技術(shù)的發(fā)展也為抗菌肽的基因工程化提供了良好的技術(shù)支持[2]。因此，系統(tǒng)了解基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽技術(shù)利弊尤為重要。 1 抗菌肽的主要生產(chǎn)方式及困難因素 目前獲得抗菌肽的方式主要有以下幾種：(1) 從生物體內(nèi)直接分離提純有生物活性的抗菌肽，再對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。近年來研究者在不同的動(dòng)物中都取得了較好的進(jìn)展，不僅從豬、牛等[5-6]常見動(dòng)物中，也從大鯢、黑水虻[7-8]等生物中分離提純出了有活性的抗菌肽。但這種方法比較繁瑣，且得到的抗菌肽含量普遍很低，不適合進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，僅適合進(jìn)行技術(shù)開發(fā)。(2) 人工合成抗菌肽，根據(jù)已知的抗菌肽基因序列，用化學(xué)的方法合成抗菌肽[9-10]。但這種方法成本高、價(jià)格貴，不適于廣泛普及應(yīng)用。(3) 酶解法，主要是通過將有抗菌活性的蛋白用特定的蛋白酶切割下其有抗菌活性的部分進(jìn)行純化，繼而得到抗菌肽。魚鱗抗菌肽就是通過該法得到的[11]。 Esmaeilpour 等[12]也通過該法從山羊乳清蛋白中分離提純出了有活性的抗菌肽。這種方法得到的抗菌肽活性較高，但是純化比較麻煩，產(chǎn)量低，需要的成本也較高。以上 3 種方式都是獲得抗菌肽的可行手段，但都因存在其短板而制約抗菌肽的規(guī)�；a(chǎn)。而利用基因工程菌來生產(chǎn)抗菌肽，可以在一定程度上解決這些困難。通過這種方法得到的抗菌肽目的性強(qiáng)，技術(shù)上有提高產(chǎn)量的技術(shù)空間，特別是應(yīng)用可食用工程菌，成本低、應(yīng)用廣，是生產(chǎn)抗菌肽的一條理想途徑。 2 基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽 目前用于基因工程菌的異源表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)不同大小、折疊和復(fù)雜性的異源抗菌肽方面取得了很大的進(jìn)步。不同的抗菌肽因其不同的特征，在選擇用于生產(chǎn)的宿主系統(tǒng)時(shí)應(yīng)該仔細(xì)挑選，例如大小、細(xì)胞內(nèi)的定位或分泌、正確的折疊和糖基化的方式等。有研究表明，抗菌肽生產(chǎn)的主要表達(dá)系統(tǒng)是細(xì)菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)。作為表達(dá)系統(tǒng)，他們的組成基本相同，都是由外源基因、表達(dá)載體及宿主菌組成。但又由于真核與原核的差異，也使得它們存在著各自的特點(diǎn)。具體的將在下面章節(jié)進(jìn)行簡單的論述。 2.1 大腸桿菌生產(chǎn)抗菌肽 2.1.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最早的表達(dá)系統(tǒng)，對其的研究也就更為深入，在所有基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽的方法中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是最常見的。清晰的遺傳學(xué)背景、成熟的表達(dá)技術(shù)以及菌體生長快等特點(diǎn)使其得到了廣泛的應(yīng)用。這也使各種類型的抗菌肽都實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)。研究表明一般抗菌肽在大腸桿菌中的表達(dá)量因載體種類和抗菌肽的種類不同而不同，人源抗菌肽表達(dá)產(chǎn)量多數(shù)是比較高的[13]。例如，復(fù)合抗菌肽 AL32-P113 和重組抗菌肽 UBI 18-35 實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達(dá)，并得到了可觀的表達(dá)量 12.1 mg/L[14]和 6 mg/L[15]。但其他抗菌肽也有一定的開發(fā)空間，如 Fowlicidin-3在大腸桿菌 BL21 Rosetta 中的融合表達(dá)，得到了表達(dá)量為 0.84 mg/mL 和 0.71 mg/mL 的抗菌肽Trx-Fowlicidin-3a 和 Trx-Fowlicidin-3b[16]。抗菌肽SMAP-29 融合表達(dá)時(shí)，對表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化后得到了最高表達(dá)量占菌體 11.35%的抗菌肽 SMAP-29[17]。黃粉蟲抗菌肽基因在大腸桿菌中也取得了較高抗菌肽表達(dá)量，占細(xì)菌總蛋白的 40%以上[18]。目前，用大腸桿菌來生產(chǎn)抗菌肽的方法已經(jīng)十分的成熟，并取得了廣泛的應(yīng)用，是抗菌肽規(guī)�；a(chǎn)的一條有效途徑。 2.1.2 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽的困難因素 影響大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽的因素：(1) 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于沒有像真核生物一樣后期的翻譯即修飾蛋白的能力，導(dǎo)致了中間產(chǎn)物的過度累積，容易形成包涵體結(jié)構(gòu)。包涵體的形成有利有弊，首先在表達(dá)抗菌肽的技術(shù)中存在有利的生物技術(shù)策略，因?yàn)檫@能形成豐富而又比較純的重組蛋白，易于從宿主中分離，其次還能抵抗體內(nèi)蛋白酶分解。缺點(diǎn)就是目標(biāo)肽在包涵體構(gòu)成過程一般是不可直接控制的，而有效控制的方法是在融合表達(dá)過程中有望進(jìn)行包涵體的表達(dá)[19]。由于后期的翻譯能力弱，也使得分泌的抗菌肽的穩(wěn)定性較弱，活性弱。(2) 容易產(chǎn)生內(nèi)毒素，這會(huì)導(dǎo)致抗菌肽在后期表達(dá)過程中容易對宿主造成“自殺現(xiàn)象”，即殺滅本身的宿主菌。(3) 表達(dá)載體的選擇。不同類型的表達(dá)載體也會(huì)對抗菌肽的生產(chǎn)產(chǎn)生不同的影響，目前常見的功能性的表達(dá)載體有 3 種[20]：非融合型、融合型以及分泌型的表達(dá)載體。非融合型表達(dá)載體的主要特點(diǎn)是得到的抗菌肽與天然抗菌肽有著很高的相似性，如pPL-Lamda；融合型表達(dá)載體可以簡化提純步驟，如 pGEX 系列；分泌型表達(dá)載體的主要優(yōu)點(diǎn)是防止分泌的抗菌肽被宿主菌體內(nèi)的蛋白酶降解，如pEZZ18。(4) 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)條件也會(huì)對大腸桿菌生產(chǎn)抗菌肽產(chǎn)生影響，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)理想的培養(yǎng)條件是，有適量的微量元素如：Mg2+、Ca2+、K+和 NH4+以及充足的能量等。 2.2 酵母菌生產(chǎn)抗菌肽 2.2.1 酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽 酵母是真核生物，本身具備單細(xì)胞快速生長和易于遺傳操作的優(yōu)點(diǎn)，除此之外，對后期蛋白質(zhì)的正確加工和翻譯后的修飾都要強(qiáng)于大腸桿菌。表現(xiàn)在酵母的糖基化以及多聚糖結(jié)構(gòu)糖蛋白的產(chǎn)生。由于它們眾多優(yōu)點(diǎn)使其作為表達(dá)系統(tǒng)的研究也不斷深入。畢赤酵母是酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，但由于沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，在表達(dá)外源抗菌肽基因時(shí)，所用的表達(dá)載體幾乎都是可以直接整合到酵母基因組中的整合型質(zhì)粒載體，如 pPICZ 和 pIPC3k 等。表達(dá)系統(tǒng)中用于生產(chǎn)抗菌肽的宿主菌株都是通過原野生型菌株 NRRL-Y11430 經(jīng)過改良得到的[21]。畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，可以在只有甲醇的培養(yǎng)基中生長，而在其他培養(yǎng)基中幾乎不生長，因而甲醇可以用于轉(zhuǎn)化后重組菌株的篩選。有研究表明，與大腸桿菌相比畢赤酵母往往能取得更好的效果。例如，抗黃曲霉毒素 B1 在大腸桿菌和畢赤酵母中分別表達(dá)，但后者的表達(dá)量是前者的 1.3 倍[22]。多種抗菌肽實(shí)現(xiàn)了在酵母菌中的表達(dá)，而且得到了可觀的表達(dá)量�？咕� Moricin 的基因經(jīng)擴(kuò)增后導(dǎo)入畢赤酵母，實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵在上清液中得到 248.98 mg/L 的重組蛋白[23]，經(jīng)檢測有明顯的抑菌活性�？咕� Snakin-1 在畢赤酵母中成功表達(dá)，得到了表達(dá)量為 40 mg/L 的抗菌肽[24]。重組表達(dá)載體 pPICZαA-GST-Apidaecin 在畢赤酵母菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，成功表達(dá)出有明顯抗菌活性的 Apidaecin型抗菌肽，表達(dá)量為 1.76 g/L[25]。以上研究表明，通過畢赤酵母菌生產(chǎn)抗菌肽是一種有效的生產(chǎn)方法，而且相對于大腸桿菌，作為真核表達(dá)系統(tǒng)的畢赤酵母具有更多的優(yōu)勢。 2.2.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽的困難因素 外源抗菌肽基因在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，有很多的因素都會(huì)影響抗菌肽的生產(chǎn)。(1) 外源抗菌肽基因自身的內(nèi)在因素。選用畢赤酵母偏愛的密碼子可以在一定程度上提高抗菌肽的表達(dá)效率。(2) mRNA 5′端非翻譯區(qū)的組成長度與 AOX1/MOX 保持一致也可以提高抗菌肽產(chǎn)量。(3) UTR 序列、A+T含量和基因的拷貝數(shù)等都會(huì)在一定程度上限制抗菌肽的生產(chǎn)量。研究表明，A+T 含量在 30 mol%−55 mol%之間為最好，A+T 的含量越高越容易產(chǎn)生類似終止子之類的結(jié)構(gòu)，影響抗菌肽的生產(chǎn)。(4) 畢赤酵母自身分泌蛋白酶，對外源抗菌肽有一定的溶解作用，這是其面臨的主要問題。目前主要的解決方式是通過降低培養(yǎng)基 pH以及在培養(yǎng)基中添加蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物等方式來提高抗菌肽的表達(dá)量，除此之外采用蛋白酶缺陷的宿主菌如 SMD1168 也可以提高其生產(chǎn)量。 2.3 枯草芽胞桿菌生產(chǎn)抗菌肽 2.3.1 枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽 枯草芽孢桿菌是遺傳和生理水平最好的革蘭氏陽性菌之一。其染色體的整個(gè)序列是已知的，這極大地加快了基因工程技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)程。經(jīng)過多年努力，芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)克隆和表達(dá)了多種真核和原核的外源基因。徐建[26]成功構(gòu)建表達(dá)載體 pMK-BD-2/CP1，并實(shí)現(xiàn)了融合抗菌肽 pBD-2/cecropin P1 在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，表達(dá)量為 45 mg/L，經(jīng)驗(yàn)證有良好的抗菌活性。魏丹丹等[27]將 2 個(gè)含抗菌肽 PR-FO 基因的表達(dá)載體質(zhì)粒，分別導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，最終得到了具有抗菌活性的表達(dá)量為 3 mg/L 和 4 mg/L的抗菌肽 PR-FO。通過人工合成抗菌肽的目的基因序列，將其與表達(dá)載體 pHT43 進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pHT43/SS-BD[28]和 pHT43/CC34[29]，轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌中，成功表達(dá)出有抑菌效果的抗菌肽 β-defensi 和 CC31。除此之外，抗菌肽陰極素-BF和抗菌肽Abaecin也實(shí)現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，表達(dá)量分別為 0.5 mg/L 和 3 mg/L[30-31]。以上研究表明，枯草芽孢桿菌作為基因工程菌也為抗菌肽的生產(chǎn)提供了一條良好的途徑。 2.3.2 枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽的困難因素 枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)在抗菌肽的生產(chǎn)中主要有以下幾點(diǎn)限制因素：(1) 枯草芽孢桿菌本身分泌蛋白酶，會(huì)降解一部分分泌表達(dá)的抗菌肽而影響表達(dá)量。(2) 不能高效的表達(dá)，抗菌肽的表達(dá)效率低，這也是其亟待解決的問題。(3) 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性表現(xiàn)在兩方面，即結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性和分離的不穩(wěn)定性。前者容易引起抗菌肽基因片段的丟失和結(jié)構(gòu)的改變，后者容易導(dǎo)致表達(dá)載體質(zhì)粒的丟失。使用整合性質(zhì)粒是解決質(zhì)粒不穩(wěn)定性的一條有效途徑。 2.4 乳酸菌生產(chǎn)抗菌肽 2.4.1 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽 乳酸菌是一種益生菌，本身就可以產(chǎn)生抗菌和殺菌物質(zhì)，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，表達(dá)的抗菌肽和菌體可以一起用來飼喂動(dòng)物，經(jīng)過改造的乳酸菌幾乎不分泌本源蛋白，也就間接降低了抗菌肽被內(nèi)部分解的風(fēng)險(xiǎn)。因此它與其他表達(dá)系統(tǒng)相比存在一些天然優(yōu)勢。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展也使乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)有了更進(jìn)一步的發(fā)展。有研究表明已有抗菌肽在乳酸菌中實(shí)現(xiàn)成功表達(dá)，例如李樸等[32]成功實(shí)現(xiàn)了抗菌肽 Baetenecin7 在乳酸菌中的表達(dá)，得到了具有生物活性的抗菌肽 Baetenecin7。但并沒有實(shí)現(xiàn)對其表達(dá)量的測定。譚嘉圣[33]也成功實(shí)現(xiàn)了人源抗菌肽 LL-37 在乳酸菌 NZ9000 中的表達(dá)。這表明了乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)作為一種新型表達(dá)系統(tǒng)，也有著生產(chǎn)抗菌肽的潛能。也可以作為抗菌肽開發(fā)以及規(guī)�；a(chǎn)的途徑。 2.4.2 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗菌肽的困難因素 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)作為生產(chǎn)抗菌肽的新興系統(tǒng)，已慢慢被人們所熟知以及應(yīng)用，但也存在一些問題與不足。首先就是乳酸菌作為表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)抗菌肽方面的研究報(bào)道較少，目前對乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的研究還處于探索階段，對其遺傳背景的認(rèn)識(shí)還很薄弱，這限制了其發(fā)展。其次蛋白表達(dá)效率低以及信號(hào)肽分泌效率的不穩(wěn)定都是影響抗菌肽生產(chǎn)的重要因素。 2.5 基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽模式圖 為了能更直觀地看到抗菌肽在基因工程菌的生產(chǎn)過程，圖 1 為抗菌肽在基因工程菌中生產(chǎn)過程的模式圖。 圖片 3 小結(jié)與展望 在抗生素濫用的大背景下，抗菌肽擁有著眾多優(yōu)點(diǎn)無疑是代替抗生素的最佳選擇，但抗菌肽的開發(fā)一直是亟待解決的難題，雖然通過基因工程菌生產(chǎn)抗菌肽在一定程度上解決了抗菌肽的生產(chǎn)困難，但也面臨著眾多的問題。(1) 基因工程得到的抗菌肽與天然純化分離得到的抗菌肽存在差異。(2) 表達(dá)產(chǎn)量低。(3) 抗菌肽的毒性問題，有研究表明部分抗菌肽會(huì)導(dǎo)致受體細(xì)胞的自殺行為，以及分泌的抗菌肽也會(huì)殺傷受體細(xì)胞。(4) 本身分泌蛋白酶，會(huì)降解抗菌肽，影響抗菌肽的表達(dá)量。面對以上問題目前采取的主要解決方式是利用生物信息學(xué)對抗菌肽分子進(jìn)行改造。(1) 利用生物信息技術(shù)對抗菌肽的分子構(gòu)造進(jìn)行改造，以期得到對宿主殺傷性小，不易被宿主分泌的蛋白酶分解的新型抗菌肽。(2) 抗菌肽基因的串聯(lián)技術(shù)，對抗菌肽基因進(jìn)行串聯(lián)，通過提高抗菌肽目的蛋白的產(chǎn)量來間接提高抗菌肽的表達(dá)量，這是一種提高抗菌肽表達(dá)量的方法。除此之外，對抗菌肽進(jìn)行串聯(lián)也可以掩蔽單體抗菌肽的活性，來達(dá)到降低抗菌肽毒性的目的。(3) 融合表達(dá)，有研究表明，將抗菌肽與防止蛋白酶降解的基因進(jìn)行融合表達(dá)，可以降低抗菌肽在宿主菌內(nèi)被其分泌的蛋白酶分解的風(fēng)險(xiǎn)。另一種防止抗菌肽被宿主蛋白酶分解的方法就是采用包涵體的形式表達(dá)。這樣不僅可以降低抗菌肽被分解的風(fēng)險(xiǎn)，也降低了抗菌肽本身對宿主菌的毒害作用。面對眾多的難題，雖然研究者采取了相應(yīng)的措施，但如何獲得產(chǎn)量高、活性更好的抗菌肽還需進(jìn)一步探索，近年來越來越多抗菌肽分子改造技術(shù)以及表達(dá)系統(tǒng)的新技術(shù)相繼被報(bào)道，也為抗菌肽的開發(fā)帶來了更多的選擇。相信在不久的將來，在研究者的不斷努力下，抗菌肽勢必會(huì)有更好的未來，來造福于人類。 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3樓2023-03-11 20:14:47
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nono20092樓
2023-03-11 20:11
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[考研] 數(shù)二英二309分請求調(diào)劑 +3 | dtdxzxx 2026-03-09 | 4/200 |
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[考研] 348求調(diào)劑 +3 | wyx79618 2026-03-06 | 7/350 |
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[考研] 086000生物與醫(yī)藥319分求調(diào)劑 +4 | Tolkien 2026-03-07 | 4/200 |
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[基金申請] 第二個(gè)面上項(xiàng)目的獲批幾率如何？ +3 | wawm9296 2026-03-04 | 5/250 |
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[考研] 一志愿山東大學(xué)105500藥學(xué)專碩，總分302求調(diào)劑 +5 | 五維天空 2026-03-04 | 11/550 |
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[考研] 一志愿武理314求調(diào)劑 +4 | （￣～￣;） 2026-03-08 | 5/250 |
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[考研] 2026考研求調(diào)劑-材料類-本科211一志愿985-初試301分 +7 | 蟲友233 2026-03-07 | 7/350 |
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[考研] 一志愿中科大能動(dòng)297求調(diào)劑，本科川大 +4 | 邵11 2026-03-03 | 4/200 |
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[考研] 337一志愿華南理工材料求調(diào)劑 +4 | mysdl 2026-03-07 | 4/200 |
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[考研] 一志愿鄭大071000分?jǐn)?shù)282求調(diào)劑 +3 | 研研顏 2026-03-05 | 7/350 |
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[考研] 0307化學(xué)求調(diào)劑 +6 | 0ok0k 2026-03-07 | 6/300 |
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[考研] 080500材料科學(xué)與工程 +13 | 202114020319 2026-03-03 | 13/650 |
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[考研] 271求調(diào)劑 +7 | 月色c 2026-03-05 | 8/400 |
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[考研] 材料學(xué)碩080500復(fù)試調(diào)劑294 +3 | 四葉zjz 2026-03-04 | 3/150 |
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[考研] 材料專碩346求調(diào)劑 +3 | 旺一下 2026-03-04 | 3/150 |
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[考研] 295求調(diào)劑 +6 | 等春來， 2026-03-04 | 6/300 |
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[考研] 武理材料工程302調(diào)劑 +3 | Doleres 2026-03-03 | 6/300 |
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[考研] 312求調(diào)劑 +8 | 醋精華了一下發(fā)?/a> 2026-03-03 | 10/500 |
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[考研] 293求調(diào)劑 +4 | 是樂渝哇 2026-03-03 | 4/200 |
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