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神經(jīng)細胞原代培養(yǎng) 已有1人參與
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實驗方法原理 神經(jīng)細胞的原代培養(yǎng)是盡 量 創(chuàng)造最適合于各類神經(jīng)細胞生長的體外環(huán)境，獲得狀態(tài)良好，純度較高細胞的方法 。 由于腦部組織來源的各種神經(jīng)細胞的培養(yǎng)具有相似的取材過程和部分通用的培養(yǎng)條件。 實驗材料 動物組織 試劑、試劑盒 消化液(0.25%胰蛋白酶+O.04%的EDTA)完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清＋雙抗）D-PBS液多聚賴氨酸（包被濃度1OOµg ml)滅菌超純水殯伏75%酒精 儀器、耗材 體視顯微鏡相差顯微鏡精細器械（彎鑷、直鑷、虹膜剪、75%酒精消毒）眼科器械（彎鑷、直鑷、剪刀共3套高壓消毒）各種規(guī)格細胞培養(yǎng)瓶和皿（均來自Nunc公司）彎頭滴管1ml刻度滴管15ml離心管100mm玻璃皿200目細胞篩網(wǎng)低溫冰袋 實驗步驟 除動物消毒以外，其他步驟都在超凈臺內(nèi)進行 。 1. 動物的消毒：根據(jù)培養(yǎng)細胞的類型和要求不同，常用胎鼠和新生鼠做神經(jīng)細胞的培養(yǎng) 。 消毒方法分別如下 。 (1) 孕鼠操作 孕鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，以棉球蘸碘伏擦拭腹部毛皮消毒 。 擦拭從中心向外方向進行，可更換棉球 1- 2次，面積盡量大一些，包括整個腹部和外生殖器周圍 。 用第 1 套解剖器械打開動物腹腔，換第 2 套器械分離子宮并置于寒冷 D PBS 的 100mm 玻璃皿中，再換第 3 套器械在每只胎鼠的間隔處剪開子宮并剝離出胎鼠 。 (2) 仔鼠操作 仔鼠（新生 7d 以內(nèi)）直接浸泡于冰的 75%酒精中， -20℃冰箱低溫消毒 10min 左右，動物失去知覺即可開始取材 。 2. 皮層組織的分離：新生鼠使用眼科剪將動物斷頭，并用鑷子剝除頭部的皮膚 。在冰 D -PBS 液中沿顱骨人字縫從后向前剝離 。 一般左手持彎鑷，在動物兩眼處以適當(dāng)力度固定；右手持直鑷，完成剝除皮膚 、 骨骼以及分離組織等工作 。 在顯微鏡下利用精細器械分離皮層或海馬時，沿皮層邊緣以 45° 角小心劃開，并逐步使之剝離，轉(zhuǎn)移組織入盛有冰 D - PBS 液的 35mm 小皿中；然后用精細器械仔細去除每個皮層或海馬的腦膜（整個過程需要在低溫冰袋上完成） 。 3.組織的分散:用管口較粗的彎頭滴管吸去帶有腦膜的 D - PBS, 盡最去除干凈液體并避免吸走組織；用虹膜剪將組織逐撮均勻剪成乳糜狀，使組織塊為 lmm3 的大小為宜 。 加入合適體積的消化液（－般蓋過組織塊并且可以隨意搖晃即可），并均勻分散組織，放入37°C 孵育箱中消化約 15min (每間隔 3 -5min 用手輕輕搖晃1次，動物胎齡越小，越容易分散，消化時間可相應(yīng)縮短） 。 4. 單細胞懸液的制備:用口徑較粗的彎頭滴管將消化好的組織吸入含 3 - 5ml 冰的完全培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，靜置 5min 左右 。 用同樣的滴管將沉底的組織轉(zhuǎn)移到另 一個含約 5ml 冰的完全培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，并開始吹打 。 吹打時每次不超過 15 次，先用粗口徑的彎頭滴管吹散，靜置片刻后將上清用細口徑彎頭滴管轉(zhuǎn)移至另 一個離心管中，并再吹打 15 次左右 。 在原先含沉淀的離心管中再加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)吹打，并收集上清重復(fù)上述過程 。 反復(fù)吹打幾次后，組織塊基本消失，將全部上清過 200 目篩網(wǎng)以去除剩余組織塊并收集、計數(shù) 。 離心 (900r/min, 5min) 去除細胞碎片并將細胞重懸至合適的體積，以備后用 。 作者：畢合生物 公眾號：畢合生物 以上內(nèi)容由畢合生物（https://www.bihebio.com)提供服務(wù)內(nèi)容：分子生物學(xué)、免疫, 重組蛋白及ELISA相關(guān)、活性小分子化合物、高端化學(xué)、材料化學(xué)、細胞資源庫與培養(yǎng)相關(guān)、生命科學(xué)、天然產(chǎn)物 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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2樓2023-03-14 14:45:21
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