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合肥肽庫(kù)生物新蟲(chóng) (著名寫手)
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[交流]
抗體結(jié)合方法綜述
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介紹 1890年代，Emil von Behring和Kitasato Shibatasaburo首次使用“抗體”一詞來(lái)定義血清中和毒素的部分。此后，這些Y形分子在人體免疫系統(tǒng)的研究中起著中心作用。它們對(duì)與其同源抗原結(jié)合的特異性和親和力也使它們可用于診斷和治療。如今，可通過(guò)各種修改和應(yīng)用獲得定制抗體。這篇綜述試圖全面介紹各種類型的抗體，綴合物，綴合方法，它們的優(yōu)缺點(diǎn)和用途。 抗體 抗體是可溶性Y形球蛋白，響應(yīng)于抗原的存在，由免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞合成和分泌。具有可變區(qū)和高可變區(qū)的抗原結(jié)合位點(diǎn)（Fab）通常不考慮綴合，因?yàn)檫@會(huì)干擾表位的結(jié)合。而且，在鉸鏈區(qū)的破壞使分子具有結(jié)合的靈活性，可能破壞抗原相互作用。因此，在制備抗體-綴合物時(shí)，必須盡可能保持Fab和鉸鏈區(qū)不受干擾。 迄今為止，鑒定出的所有五類抗體-IgG，IgM，IgA，IgD和IgE已用于研究，診斷和治療。同樣，多克隆和單克隆（嚙齒動(dòng)物和人）抗體均已與報(bào)告系統(tǒng)偶聯(lián)。也已經(jīng)報(bào)道了與抗體片段和抗體變體的綴合。這些包括 -人骨髓瘤細(xì)胞系分泌的輕鏈（λ或κ）[ 1 ]。抗原結(jié)合（Fab），重鏈和輕鏈的可變區(qū)（FV），重鏈的可變區(qū)（Vh）和噬菌體展示表達(dá)單鏈可變區(qū)（scFv）。[ 2 ]人源化抗體是嵌合分子，其表達(dá)與人抗體恒定域融合的嚙齒動(dòng)物單克隆抗體的可變域[ 3 ]。駱駝抗體僅由重鏈組成，存在于駱駝/單峰駱駝和新世界駱駝科動(dòng)物中，例如美洲駝和羊駝[ 4 ]。它們具有高親和力，特異性，高熱穩(wěn)定性和溶解性。 普通共軛化學(xué) 抗體上結(jié)合的首選位點(diǎn)是賴氨酸的–NH 2（胺）基團(tuán)或半胱氨酸的游離–SH（巰基）基團(tuán)[ 5 ]。盡管綴合化學(xué)平等地對(duì)待所有可及殘基，但可以綴合的分子數(shù)量受到以下限制： 反應(yīng)的pH依賴性：可以標(biāo)準(zhǔn)化僅允許特定基團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)條件，以獲得最佳的Ab：報(bào)告分子比例。例如，在堿性pH下，某些脂族胺基團(tuán)的反應(yīng)性遠(yuǎn)高于其他基團(tuán)。在堿性pH下也存在總體抗體穩(wěn)定性的問(wèn)題。在這些條件下限制反應(yīng)時(shí)間至關(guān)重要，以避免抗體變質(zhì)。共軛的半胱氨酸殘基在堿性pH下易于碎裂[ 6 ]。這就是為什么大多數(shù)商業(yè)偶聯(lián)試劑盒設(shè)計(jì)為在15-30分鐘內(nèi)完成偶聯(lián)反應(yīng)，并且通常靶向賴氨酸的伯胺基的原因（請(qǐng)參見(jiàn)表5）。另一種選擇是工程改造抗體以將pI從8-9更改為5-6 [ 7 ]。這確保了抗體在結(jié)合反應(yīng)期間不會(huì)沉淀。 綴合物的大小：小分子（如半抗原或藥物）可以以抗體：綴合物::: 1：4或什至1:10的最小比例綴合。像酶這樣的較大分子的每個(gè)抗體只能被限制為兩個(gè)分子。對(duì)于寡核苷酸，該比例為1：1。 Fab中賴氨酸和半胱氨酸殘基的存在決定了Ag的結(jié)合，因此不應(yīng)進(jìn)行綴合。平均而言，IgG分子具有約80個(gè)賴氨酸殘基，其中20個(gè)存在于溶劑可及部位。半胱氨酸殘基分布更均勻，數(shù)量更少。大約16對(duì)半胱氨酸殘基以12個(gè)鏈內(nèi)和4個(gè)鏈間二硫鍵存在。鏈間半胱氨酸通常由于其溶劑可及性而成為偶聯(lián)目標(biāo)[ 8 ]。 為了增強(qiáng)綴合的功效，可以通過(guò)引入異常氨基酸或化學(xué)修飾來(lái)改變抗體。 氨基酸替代 減少不良結(jié)合的數(shù)量的一種方法是用硒代半胱氨酸代替半胱氨酸。這降低了在多肽鏈的不適當(dāng)位點(diǎn)發(fā)生綴合的可能性，這些綴合破壞了抗體的結(jié)構(gòu)（并因此破壞了其親和力和/或特異性）[ 9 ]。 在抗體-藥物偶聯(lián)物使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾谷氨酰胺殘基的情況下，已采用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)修飾醛標(biāo)記的蛋白的C末端并引入非天然氨基酸（例如對(duì)乙�；奖彼幔﹣�(lái)產(chǎn)生特異性，穩(wěn)定和高產(chǎn)的結(jié)合物[ 10 ]。 試劑性質(zhì)好處缺點(diǎn)參考Traut試劑（2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷）在pH 7.0下將伯胺轉(zhuǎn)化為巰基保持正電荷保持蛋白質(zhì)溶解度足夠的間隔臂長(zhǎng)度減少空間位阻不太通用[ 11 ]MBS（3-馬來(lái)酰亞胺基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯）將胺改性為巰基，與其他分子形成硫醚鍵高度穩(wěn)定的聯(lián)動(dòng)僅用于研究和診斷目的[ 12 ]SPDP（N-琥珀酰亞胺基3-（2-吡啶基二硫）丙酸酯）通過(guò)短鏈交聯(lián)劑修飾游離胺基。引入的巰基部分可通過(guò)二硫鍵連接至半胱氨酸�？梢酝ㄟ^(guò)跟蹤在343 nm處吡啶-2-硫酮的釋放來(lái)評(píng)估共軛反應(yīng)�？梢酝ㄟ^(guò)10-50 mM DTT甚至pH 8.5的SDS-PAGE樣品上樣緩沖液輕松裂解與半胱氨酸巰基形成的二硫鍵。SPDP有多種聚乙二醇化形式，允許更長(zhǎng)的間隔臂長(zhǎng)度。由于不溶于水，應(yīng)使用高濃度的二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）中的試劑將反應(yīng)混合物中的有機(jī)溶劑保持在最低水平。[ 13 ]SATA（N-琥珀酰亞胺S-乙酰硫代乙酸酯）共價(jià)修飾伯胺以生成保護(hù)的巰基。添加短鏈（2.8埃間隔臂）試劑通過(guò)添加溫和試劑（例如羥胺-HCl）進(jìn)行脫酰作用，以生成游離巰基。因此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能不受影響。可以長(zhǎng)期保存巰基修飾的抗體。與其他含巰基的分子形成可裂解的二硫鍵與賴氨酸殘基的伯胺形成高度穩(wěn)定的酰胺鍵SMCC（4-（N-馬來(lái)酰亞胺甲基）琥珀酰亞胺基環(huán)己烷-1-甲酸）同時(shí)包含N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。具有伯胺的NHS部分在pH 7–9下發(fā)生，形成酰胺鍵。試劑的馬來(lái)酰亞胺部分與另一個(gè)分子在pH 6.5-7.5下的巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵環(huán)己烷基團(tuán)增強(qiáng)了馬來(lái)酰亞胺衍生的硫醚的穩(wěn)定性。這些衍生物可在0.1 M磷酸鈉緩沖液（pH 7為4°C）中保存長(zhǎng)達(dá)64小時(shí)。修飾的蛋白質(zhì)也可以凍干并保存，以便以后與含巰基的分子綴合。形成的鍵是不可裂解的，SMCC是不溶于水的。因此，應(yīng)使用試劑在DMF或DMSO中的高濃度溶液。[ 14 ]磺基SMCC還同時(shí)包含N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)。具有伯胺的NHS部分在pH 7–9下發(fā)生，形成酰胺鍵。試劑的馬來(lái)酰亞胺部分與另一個(gè)分子在pH 6.5-7.5下的巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定的硫醚鍵由于試劑是水溶性的，因此可以在生理溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。不存在有機(jī)溶劑也可以確保蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不被擾動(dòng)，就像SMCC一樣，環(huán)己烷橋可以賦予馬來(lái)酰亞胺衍生物以穩(wěn)定性，最高可以儲(chǔ)存在0.1M磷酸鈉緩沖液中（pH 7在4C下）64小時(shí)綴合物通過(guò)不可裂解的鍵結(jié)合。由于不透膜，因此不能用于細(xì)胞和組織的原位交聯(lián)[ 15 ] 圖片 表1。通過(guò)不同的試劑將伯胺轉(zhuǎn)化為巰基。 抗體的化學(xué)修飾：蛋白質(zhì)中游離巰基的引入 巰基的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們可用于形成穩(wěn)定的，可裂解的二硫鍵（-SS-）�？贵w中的大多數(shù)半胱氨酸已經(jīng)以二硫化物的形式存在，可用的半胱氨酸可能不在方便的位置。因此，可以通過(guò)用Traut's試劑（2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷），MBS，SPDP，SATA及其衍生物等試劑進(jìn)行修飾，將巰基引入伯胺的位置，尤其是賴氨酸殘基的位置。表1列出了這些試劑的某些功能。 圖片 圖1.將胺改性為巰基。A）與Traut試劑反應(yīng)生成游離巰基。B）使用SMCC產(chǎn)生不可裂解的巰基。C）使用馬來(lái)酰亞胺交聯(lián)產(chǎn)生保護(hù)的巰基。 與抗體結(jié)合的記者系統(tǒng) 酶聯(lián)抗體 與抗體連接的酶構(gòu)成酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）的基礎(chǔ)（請(qǐng)參見(jiàn)表2）。這些是IA中使用最廣泛的類型之一，并且比RIA更安全，更容易。它們將抗體-抗原相互作用的特異性與酶測(cè)定的靈敏度結(jié)合在一起。此外，由于可以在多個(gè)孔板中進(jìn)行，因此可以同時(shí)分析多個(gè)樣品。迄今為止，已基于所使用的底物開(kāi)發(fā)了三種主要類型的ELISA。最早的是使用比色法進(jìn)行檢測(cè)的免疫分析法。但是，此方法通常會(huì)檢測(cè)到0.01 ng至0.1 ng相對(duì)較低的抗原。使用熒光底物和化學(xué)發(fā)光底物可以提高ELISA的靈敏度。 酵素反應(yīng)部分結(jié)合方法好處缺點(diǎn)辣根過(guò)氧化物酶糖高碘酸法可量化的結(jié)果不能用于整個(gè)電池尿素酶胺類戊二醛由于沒(méi)有內(nèi)源性脲酶活性，因此可用于全細(xì)胞交聯(lián)的特異性可能不確定堿性磷酸酶胺類NHS，馬來(lái)酰亞胺-硫醇偶聯(lián)可量化的結(jié)果不能用于整個(gè)電池β-半乳糖苷酶胺類4-（N-馬來(lái)酰亞胺基甲基）-環(huán)己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亞胺酯（磺基SMCC）可用于細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映了較高系統(tǒng)的真正Ab-Ag反應(yīng)，因?yàn)闆](méi)有固有的β-gal活性 圖片 表2。酶抗體結(jié)合物及其用途。 酶聯(lián)抗體的結(jié)合方法和用途 酶與抗體的綴合可以基于酶中糖或賴氨酸基團(tuán)的連接。糖蛋白上存在的糖的高碘酸鈉氧化使其易于與抗體中賴氨酸殘基的末端胺（–NH 2）反應(yīng)。這在糖蛋白和抗體之間形成穩(wěn)定的共價(jià)連接。這是將諸如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）之類的酶與抗體偶聯(lián)的選擇方法[ 16 ]。 圖片 圖2.高碘酸鈉法在抗體的賴氨酸殘基上產(chǎn)生了酶的氧化糖和–NH 2之間的席夫堿。 脲酶與抗體的綴合已經(jīng)通過(guò)簡(jiǎn)單的戊二醛交聯(lián)完成。戊二醛，如己二酸二甲酯和同源的亞磺酸二甲酯，是同雙功能交聯(lián)劑[ 17 ]。這些分子的兩端均具有相同的活性基團(tuán)，并且具有足夠長(zhǎng)的“連接基”。這些通常用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)，因此用于抗體-酶結(jié)合。活性端基針對(duì)兩種蛋白質(zhì)上的賴氨酸和羥基賴氨酸的末端胺（-NH 2）。 使用這些交聯(lián)劑的優(yōu)點(diǎn)是易于進(jìn)行反應(yīng)。將待交聯(lián)的蛋白質(zhì)與試劑在合適的無(wú)胺緩沖液中溫育，然后通過(guò)柱色譜法分離高分子量蛋白質(zhì)。明顯的缺點(diǎn)是非特異性交聯(lián)導(dǎo)致形成不符合目的的大蛋白聚集體。 圖片 圖3.用于酶-抗體結(jié)合的同雙功能交聯(lián)劑。 脲酶結(jié)合物已用于研究[ 18 ]和一些肝炎[ 19 ]和梅毒[ 20 ]的診斷測(cè)試。脲酶活性的檢測(cè)方法包括在溴甲酚紫存在下隨著氨的析出從黃色到紫色的比色過(guò)渡。這對(duì)于確定經(jīng)驗(yàn)值很有用。但是，可以使用結(jié)合了β-半乳糖苷酶的抗體對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量，這對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞也具有較低的背景[ 21 ]。現(xiàn)在，細(xì)胞ELISA（流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記細(xì)胞的前體）更喜歡將β-半乳糖苷酶結(jié)合的抗體用于尿素酶結(jié)合的抗體。 這些結(jié)合物可用于ELISA，Western印跡/斑點(diǎn)印跡，免疫組織化學(xué)（IHC），最近還針對(duì)實(shí)體瘤[ 22 ]。 FLIA和熒光染料標(biāo)記的抗體 熒光染料具有吸收一個(gè)波長(zhǎng)的電磁輻射，然后以更長(zhǎng)的波長(zhǎng)發(fā)射該波長(zhǎng)的特性。斯托克位移對(duì)于檢測(cè)少量目標(biāo)化合物/代謝物/蛋白質(zhì)至關(guān)重要。 熒光標(biāo)記的抗體賦予結(jié)合特異性，可用于定位。在熒光標(biāo)記中，連接至熒光團(tuán)核心的琥珀酰亞胺酯官能團(tuán)靶向抗體上的伯胺，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵[ 23 ]�？贵w的標(biāo)記程度取決于游離的伯胺基團(tuán)的數(shù)目以及熒光團(tuán)是否在空間上影響結(jié)合的特異性，親和力或親和力。由于可以連接到抗體的熒光團(tuán)數(shù)量是有限的，因此沒(méi)有可以與該偶聯(lián)抗體家族相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。簡(jiǎn)而言之，熒光染料標(biāo)記的抗體的問(wèn)題是熒光團(tuán)太少或過(guò)多，非特異性染色以及抗體-抗原特異性或親和力喪失[ 24]]。這就是為什么熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體更多地用于免疫組化和FACS，而不是用于定量免疫測(cè)定。表3給出了已經(jīng)與抗體綴合的天然熒光染料。 名稱顏色λ ABSλ EM摩爾重量（Da）氨基甲基香豆素（AMCA）紫藍(lán)色353442410熒光素綠色495528390羅丹明橙子550570444藻紅蛋白橙子488575240,000異花青素遠(yuǎn)紅650660100,000 圖片 表3。天然熒光染料及其性質(zhì)。 大多數(shù)其他商業(yè)染料，包括Alexa染料，德克薩斯紅，都源自這些染料。表4列出了熒光染料及其發(fā)射波長(zhǎng)。 近紫外線可見(jiàn)近紅外阿托425阿托488異花青素阿托488阿托532半胱氨酸5半胱氨酸2阿托550阿托647dylight 405半胱氨酸3dylight 649DyLight 488半胱氨酸5阿托655DyLight 488Cy5.5dylight 549DyLight 680德州紅DyLight 800 圖片 表4�？梢耘c抗體偶聯(lián)的熒光染料。 商業(yè)試劑盒提供具有異硫氰酸酯修飾的熒光染料。這些染料可以使用“活化”試劑在一個(gè)步驟中偶聯(lián)到胺基上，該試劑通常是琥珀酰亞胺基4-（N-馬來(lái)酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酸酯（SMCC）。在高pH（通常為9.0）下，將SMCC在二甲基甲酰胺中的高濃度溶液與異硫氰酸酯修飾的熒光團(tuán)一起孵育。這會(huì)修飾抗體，并使其準(zhǔn)備好與熒光標(biāo)簽偶聯(lián)。添加標(biāo)簽，在室溫下孵育一個(gè)小時(shí)。然后，淬滅劑將未使用的熒光探針清除掉。建議通過(guò)HPLC純化標(biāo)記的抗體以去除未結(jié)合的探針。例如，Dong JX等人使用Thermo Fisher的琥珀酰亞胺基Alexa 647將抗Homer1納米抗體與Alexa 647偶聯(lián)（A20186）[25 ]。 鑭系元素標(biāo)記的抗體 熒光染料標(biāo)記的抗體的顯著缺點(diǎn)是樣品中可能存在的高背景散射（噪聲）和來(lái)自生物分子的非特異性熒光。這些會(huì)干擾測(cè)量并限制此類探頭的使用。在這種條件下，鑭系元素綴合的抗體具有理想的熒光團(tuán)，它們具有長(zhǎng)的斯托克斯位移（Stokes'shift），并能保持毫秒級(jí)的興奮性[ 26 ]。Han G等人發(fā)表了三種結(jié)合鑭系元素和其他稀土元素的抗體方案[ 27]。對(duì)于大規(guī)模流式細(xì)胞術(shù)，F(xiàn)luidigm Corporation提供了用于偶聯(lián)抗體的試劑盒。Rosshart SP等人使用了Fluidigm Corporation的Maxpar®抗體偶聯(lián)試劑盒來(lái)研究野生小鼠出生的實(shí)驗(yàn)室小鼠的微生物群和免疫反應(yīng)[ 28 ]。 鑭系元素（有時(shí)稱為稀土元素）是元素周期表中從原子序數(shù)57（鑭）到71（（）的14個(gè)“ f嵌段”元素的集合。其中，euro（Eu），（Dy）和g（Gd）已主要用于生物醫(yī)學(xué)成像[ 29 ]。所有這些元素都顯示出4f-5d，4f-4f躍遷，在UV范圍內(nèi)吸收，在可見(jiàn)范圍內(nèi)發(fā)射。 鑭系元素可以形成螯合物，產(chǎn)生可檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光。聚氨基羧酸鹽（PAC），例如線性乙二胺四乙酸（EDTA）和二亞乙基三胺五乙酸（DTPA）及其環(huán)狀對(duì)應(yīng)物1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）和1 4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷-1,4,8-三乙酸（DO3A）是廉價(jià)的金屬離子螯合劑，可與鑭系元素形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。綁定的順序是EDTAβ-二酮具有雙齒能力，不穩(wěn)定。但是，它們已被修飾成與鑭系元素形成3：1的絡(luò)合物，可以容納天線分子。β-二酮已經(jīng)成為DELFIA免疫測(cè)定系統(tǒng)的一部分，在該測(cè)定中，鑭系元素標(biāo)記物從非熒光螯合物免疫復(fù)合物中解離后，它們可作為溶液配體[ 26 ]。 圖片 圖4.鑭系元素的螯合劑。 鑭系元素螯合物（尤其是Eu（III）和Tb（III）的螯合物）]通過(guò)穩(wěn)定的異硫氰酸酯連接劑與帶有游離胺和/或羧基的抗體偶聯(lián)時(shí)，可檢測(cè)到少量抗原，從而使CLIA（基于化學(xué)發(fā)光的免疫測(cè)定）最敏感的免疫測(cè)定[ 30 ]這些結(jié)合物已用于臨床診斷[ 31 ]，體外DNA雜交[ 32 ]，細(xì)胞毒性測(cè)定[ 33 ]，受體-配體結(jié)合測(cè)定[ 34 ]以及作為癌癥的潛在療法[ 35 ] 。 已經(jīng)探索了其他過(guò)渡金屬用于生物測(cè)定系統(tǒng)的檢測(cè)。Meso Scale Discovery（MSD）電化學(xué)發(fā)光平臺(tái)使用釕。Chaturvedi S等人通過(guò)MSD的SULFO‐TAG™NHS-Ester試劑盒標(biāo)記了IL-6檢測(cè)抗體[ 36 ]。 其他半抗原偶聯(lián)抗體 半抗原是需要載體蛋白以引發(fā)免疫反應(yīng)的抗原性小分子。雖然熒光染料可以用作半抗原，但抗體也已與半抗原（如生物素，鏈霉親和素和生物磁珠）偶聯(lián)，以用于不同技術(shù)。 生物素/鏈霉親和素偶聯(lián)的抗體 生物素和抗生物素蛋白（或抗生蛋白鏈菌素）之間的非共價(jià)相互作用具有非常高的Kd（解離常數(shù)），使兩者之間的結(jié)合幾乎不可逆[ 37 ]。因此，一種或兩種分子與抗體的綴合使其成為檢測(cè)，定量和定位ELISA和IHC中生物分子的理想選擇。 生物素具有稠合的雜環(huán)和脂肪族戊基尾巴，而抗生物素蛋白和鏈霉親和素是蛋白質(zhì)。生物素與抗體的綴合通常是通過(guò)NHS活化分子和抗體上的胺基進(jìn)行的。一些可商購(gòu)的活化生物素制劑帶有附加的連接子，可以使分子更好地定位（請(qǐng)參閱thermoscientific.com/pi）。Silva MC等人使用Thermo Scientific EZ-LinkNHS-PEG4-Biotinylation Kit標(biāo)記tau蛋白，用于生物層干涉生物傳感器測(cè)定[ 38 ]。Chaturvedi S等人將IL-6 MSD分析捕獲抗體與Thermo-Pierce的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin試劑偶聯(lián)[ 36 ]。鏈霉親和素/抗生物素蛋白使用交聯(lián)兩個(gè)蛋白質(zhì)的雙功能試劑與抗體連接。 生物磁珠偶聯(lián)抗體 磁珠是嵌入在環(huán)氧樹(shù)脂基質(zhì)中的氧化鐵顆粒，直徑約為0.5μm。這些具有各種活化基團(tuán)，例如胺基（-NH 2），酰肼基（-N 2 H），羧基（-COOH），碘乙�；�-CHICOO），巰基（-SH）和醛基（-CHO），可商購(gòu)獲得。增強(qiáng)抗體附著力。為了促進(jìn)正確的結(jié)合方向，也可以使用與蛋白質(zhì)A /蛋白質(zhì)G偶聯(lián)的現(xiàn)成的磁珠。 共軛物的回收利用磁體完成，從而減少了離心過(guò)程中的損失。單個(gè)磁珠可結(jié)合約50-70μg抗體。這些珠粒具有中性pH值，可溫和分離蛋白質(zhì)復(fù)合物。應(yīng)避免在反應(yīng)緩沖液和抗體溶液中使用胺，硫醇和尿素。結(jié)合BSA后，可以將甘油和疊氮化物添加到存儲(chǔ)緩沖液中，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)干擾測(cè)定。磁珠偶聯(lián)的抗體在0°C最多可穩(wěn)定12-18個(gè)月。 例如，Engle DD等人將CA19-9單克隆抗體5B1和NS19-9，EGFR克隆D38B1與Thermo Fisher M-270環(huán)氧Dynabeads偶聯(lián)以進(jìn)行免疫沉淀[ 39 ]。 寡核苷酸偶聯(lián)的抗體 ELISA與PCR的合并，產(chǎn)生了免疫PCR（iPCR），這是Sano等人于1992年首次設(shè)計(jì)的[ 40 ]。在此，針對(duì)靶抗原的抗體與特定的寡核苷酸連接。抗體與抗原結(jié)合后，使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA，從而可以將正常ELISA檢測(cè)到的信號(hào)擴(kuò)增近100-10,000倍。然后根據(jù)結(jié)合和擴(kuò)增的寡核苷酸的數(shù)量計(jì)算抗原的水平。iPCR已用于檢測(cè)病毒和細(xì)菌抗原以及與腮腺炎相關(guān)的疾病特異性IgG [ 41盡管夾心式iPCR涉及接頭分子，例如生物素-親和素/鏈霉親和素系統(tǒng)，但特定寡核苷酸的直接連接也可以與抗體偶聯(lián)。在這里，寡聚體和抗體被異雙功能交聯(lián)劑活化，該交聯(lián)劑最終結(jié)合以將前者與抗體上的胺基連接。該方法的缺點(diǎn)是鍵合對(duì)通過(guò)色譜法純化結(jié)合物所需的條件的敏感性。Expedeon的CellMosaic®，Innova ThunderLink和LightningLink提供胺偶聯(lián)的寡核苷酸和抗體。 抗體-納米粒子結(jié)合 與天然分子相比，不同分子的納米顆粒具有改善的溶解度和活性曲線。當(dāng)與抗體綴合時(shí)，它們可以用于治療或診斷目的。包括默克公司（Merck＆Co。），Invitrogen Inc.和Miltenyi Biotech [ 42 ] 在內(nèi)的多家公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了幾種綴合物。 與抗體偶聯(lián)的半導(dǎo)體納米顆粒（量子點(diǎn)）已用于生物醫(yī)學(xué)成像中。使用流行的零長(zhǎng)度交聯(lián)劑EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽）[ 43 ] 將量子點(diǎn)綴合到andies 。EDC在抗體的羧基和伯胺之間形成中性酰胺鍵。EDC是一種水溶性試劑，可以輕松添加到緩沖液中，也可以通過(guò)用水或稀酸洗滌將其除去。該方法的一個(gè)缺點(diǎn)是抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可能被Fab附近的酰胺鍵的非選擇性形成所阻斷。 圖片圖5.使用EDC將報(bào)告系統(tǒng)與抗體偶聯(lián)。 同樣，膠體金納米顆粒已使用碳二亞胺方法與抗體偶聯(lián)[ 44 ]。使用檸檬酸鹽/檸康酸部分產(chǎn)生酸不穩(wěn)定鍵的不同共軛化學(xué)已用于金納米顆粒與抗體的共軛，用于診斷成像和作為藥物輸送媒介[ 45 ]。 葡聚糖結(jié)合的IgD 葡聚糖偶聯(lián)的IgD抗體首先用于研究B細(xì)胞和T細(xì)胞活化以及Ig分泌。葡聚糖是大分子，即使與（否則為非促有絲分裂的）單價(jià)Fab片段或二價(jià)抗IgM抗體偶聯(lián)時(shí)也可以觸發(fā)細(xì)胞分裂。 如今，右旋單克隆IgG被用于研究免疫球蛋白的分泌，Ig基因的類別轉(zhuǎn)換和B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)[ 46 ]和IgE表達(dá)[ 47 ]。 市售抗體偶聯(lián)試劑盒 為了簡(jiǎn)化抗體的綴合-特別是與染料，酶和納米顆粒的綴合，市場(chǎng)上有幾種可商購(gòu)的試劑盒。盡管其中一些已在特定標(biāo)記的背景下進(jìn)行了討論，但最常用的試劑盒是使用NHS交聯(lián)化學(xué)進(jìn)行半抗原結(jié)合的試劑盒（表5）。一些試劑盒可以耐受BSA和其他蛋白質(zhì)，而其他試劑盒則需要PBS抗體，通�？梢詮纳虡I(yè)供應(yīng)商處獲得。例如，Pastushok L等人用Licor IRDye 800CW蛋白標(biāo)記試劑盒在PBS緩沖液中標(biāo)記了Fab片段或抗IgG抗體，并使用Thermo Scientific的脫鹽旋轉(zhuǎn)柱從結(jié)合物中去除了游離的IRDye800CW [ 48 ]。 公司Ab抗體反應(yīng)條件時(shí)間混合n染色劑（生物素）≤5微克/毫升可以耐受BSA，明膠，甘氨酸30分鐘處理后即可使用澤農(nóng)（瑟默·費(fèi)舍爾）≤1微克/毫升可以耐受牛血清白蛋白和污染蛋白質(zhì)（例如腹水中的蛋白質(zhì)）15分鐘處理后即可使用閃電鏈接（Expedeon）0.5毫克/毫升單獨(dú)的選項(xiàng)可用于去除BSA，甘氨酸，疊氮化物。再次，從腹水或雜交瘤上清液中分離抗體的純化方案。15（快速范圍）至3 hAlexafluor（MilliporeSigma）10-50微克/毫升可以耐受BSA和污染蛋白質(zhì)15分鐘處理。標(biāo)簽可在2.5小時(shí)內(nèi)使用Abcam≤30微克/毫升可以耐受疊氮化物，甘油，EDTA。> 20分鐘處理。標(biāo)簽在3小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備就緒LYNX（比奧拉德）0.5-1毫克/毫升緩沖液的pH值接近中性處理時(shí)間3h 圖片表5。用于將抗體與染料結(jié)合的可商購(gòu)試劑盒。 抗體結(jié)合物的純化 從游離標(biāo)記/抗體分離結(jié)合的抗體 為了確保有效使用結(jié)合的抗體，有必要純化結(jié)合物。當(dāng)要結(jié)合的標(biāo)記的大小比抗體小得多時(shí)，可以使用凝膠過(guò)濾色譜法分離未結(jié)合的標(biāo)記。將標(biāo)記的抗體與未標(biāo)記的抗體分開(kāi)更困難。為了避免這種情況，可以使用過(guò)量的標(biāo)記物來(lái)確保與抗體的結(jié)合高，并可以進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。 抗體測(cè)定：標(biāo)記比例 通過(guò)計(jì)算穩(wěn)定地附著于抗體的報(bào)道分子系統(tǒng)分子的比例來(lái)確定綴合效率。這是使用光譜學(xué)或色譜法完成的。為了獲得最大效率，報(bào)道分子系統(tǒng)的濃度通常是待結(jié)合抗體濃度的十到五十倍。然后通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法將未綴合的標(biāo)記物與抗體綴合物分離。 基于比活（對(duì)于酶），熒光法（對(duì)于熒光染料）或紫外可見(jiàn)分光光度法（對(duì)于寡核苷酸）[ 49 ] 計(jì)算抗體綴合物與游離標(biāo)記的比例。將綴合物的比活或吸光度與游離標(biāo)記的比活或吸光度進(jìn)行比較，以確定綴合比（參見(jiàn)表6）。 標(biāo)簽檢測(cè)免費(fèi)標(biāo)簽結(jié)合率的測(cè)定酵素酶活性結(jié)合物的比活性/總酶的比活性–游離酶的比活性熒光染料熒光性結(jié)合物的吸光度/總標(biāo)記的吸光度-游離標(biāo)記的吸光度鑭系螯合物熒光性結(jié)合物的吸光度/總螯合物的吸光度-游離螯合物的吸光度寡核苷酸260nm處的吸光度結(jié)合物的吸光度/總寡聚物的吸光度-游離寡聚物的吸光度 圖片表6。確定各種類型標(biāo)簽的結(jié)合率。 結(jié)合效率可以使用以下等式（A 280結(jié)合抗體/ A 280非結(jié)合抗體）X 100進(jìn)行計(jì)算。 結(jié)合抗體的儲(chǔ)存 大多數(shù)抗體偶聯(lián)物制劑通常在4°C最多可穩(wěn)定六個(gè)月。不建議凍融抗體。如果要在-20°C下儲(chǔ)存偶聯(lián)物，則應(yīng)在緩沖液中加入20％甘油。熒光染料或鑭系元素螯合物標(biāo)記的抗體應(yīng)在黑暗中保存。為防止綴合的抗體制劑受到污染，可以添加防腐劑，例如0.1％的疊氮化物或硫醇汞。 抗體結(jié)合的未來(lái) 自從1942年第一個(gè)熒光團(tuán)與抗體結(jié)合以來(lái)，抗體結(jié)合物已走了很長(zhǎng)一段路。有了更好的接頭和受控的反應(yīng)，現(xiàn)在有可能設(shè)計(jì)出可以提供特定結(jié)果的結(jié)合物。在過(guò)去的二十年中，由于成功生產(chǎn)了至少兩種抗體偶聯(lián)的藥物，偶聯(lián)物的產(chǎn)生勢(shì)頭迅猛。該領(lǐng)域中的大多數(shù)研究涉及簡(jiǎn)單的綴合化學(xué)以產(chǎn)生具有更大柔韌性和穩(wěn)定性的抗體綴合物。利用可商購(gòu)的衍生化報(bào)告系統(tǒng)開(kāi)發(fā)單步方案對(duì)于在研究，診斷和治療中獲得更好的結(jié)果將是理想的。 免責(zé)聲明：本文為行業(yè)交流學(xué)習(xí)，版權(quán)歸原作者所有，如有侵權(quán)，可聯(lián)系刪除 |
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nono20095樓
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