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【實驗方法】明膠酶譜法檢測 MMP 活性
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細(xì)胞外基質(zhì)（ extracellular matrix ， ECM ）是由大分子構(gòu)成的錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。為細(xì)胞的生存及活動提供適宜的場所，并通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成份，需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子，是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶�；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）主要降解IV型膠原，基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）可以降解彈性蛋白、膠原蛋白、明膠和纖維蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的成分。基質(zhì)金屬蛋白酶的失調(diào)是多種疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。 明膠酶譜實驗可以檢測MMP2和MMP9的活性，是分子生物學(xué)的常用實驗技術(shù)之一。先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明膠）電泳分離，然后在有二價金屬離子存在的緩沖系統(tǒng)中使樣品中的MMP-2和MMP-9恢復(fù)活性，在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠，最后用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。 實驗流程如下： 圖片 No.1 樣品制備 組織或細(xì)胞的蛋白樣品制備可用常規(guī)的方法，但需注意蛋白裂解液中不能加入EDTA，因為EDTA是金屬離子螯合劑，可以絡(luò)合Zn2+，抑制MMP的活性；也不能加入β-巰基乙醇或DTT，因為會導(dǎo)致蛋白的二硫鍵被打開，蛋白不能復(fù)性。推薦用PBS或Tris緩沖液（pH7.5）作為蛋白提取的緩沖液，可以加入0.5%的PMSF。 No.2 SDS-PAGE 1)SDS-PAGE 凝膠配制 _ 10%分離膠 5%濃縮膠 總體積 10mL 6mL 30%丙烯酰胺 2.0mL 0.75mL 1.5M Tris-cl (PH 8.8) 2.5mL / 1.0M Tris-cl (PH 6.8) / 0.76mL 10%SDS 0.1mL 0.006μl 10%AP 0.1mL 0.006μl TEMED 8μl 0.006μl 明膠（10mg/mL） 1.0mL / 超純水 4.5mL 4.5mL 明膠母液配制后可在4℃保存，最好不超過1周。 2)電泳 4℃、常規(guī)電泳即可，可以適當(dāng)延長電泳時間，至溴酚藍(lán)完全出膠。上樣量一般為50μg，可根據(jù)實驗的具體情況和預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整。 注 意 ①上樣緩沖液中不能加入β-巰基乙醇或DTT，原因同上。 ②樣品與上樣緩沖液混合后直接上樣，樣品不要煮沸，高溫會導(dǎo)致蛋白不可逆的失活。 No.3 反應(yīng)和顯色 1)將凝膠置于洗脫液（2.5% Triton X-100，50mM Tris-HCl，5mM CaCl2，1μM ZnCl2，pH7. 6）中振蕩洗脫2次,每次40分鐘。 2)漂洗液（50mM Tris-HC，5mM CaCl2，1μM ZnCl2）漂洗2次,每次20分鐘。 3)凝膠置于孵育液（50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.02% Brij-35）中37℃ 孵育42-48小時。 4)染色液（考馬斯亮藍(lán)染色液）染色3小時。 染色液配方表 甲醇 乙酸 5%濃縮膠 30% 10% 0.5% 5)脫色液A、B、C分別脫色（脫色液配方及時間見附表）。 脫色液配方及脫色時間 _ 甲醇 乙酸 脫色時間 A 30% 10% 0.5小時 B 20% 10% 1小時 C 10% 5% 2小時 脫色時間可以根據(jù)觀察到的脫色效果調(diào)整。 |
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