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動物模型 | CAR-T治療相關細胞因子釋放綜合征小鼠模型的建立 已有1人參與
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CAR-T細胞療法臨床治療并發(fā)癥嚴重危害患者自身安全，如細胞因子釋放綜合征（cytokinereleasestorm，CRS）和神經不良反應等并發(fā)癥，其中，CRS為最常見的嚴重不良反應。CRS往往發(fā)生于患者接受 CAR-T細胞輸注數小時或數天后。目前，臨床醫(yī)師通過監(jiān)測血清中IL-6和C反應蛋白等因子的濃度來判斷CRS 發(fā)生的可能性以及干預時機，但這種方法需要在短時間內多次驗血以檢測相關細胞因子濃度水平，一定程度上不僅給患者帶來極大痛苦，也增加了治療成本。 簡單的體外細胞模型難以模擬CRS的發(fā)生，更難以用于探究CRS不良反應發(fā)生的關鍵機制。有研究顯示，單核細胞在CRS發(fā)生過程中發(fā)揮非常關鍵的作用。因此，選擇合適的動物模型能夠模擬臨床患者發(fā)生CRS的過程，為后續(xù)探究影響CRS 發(fā)生奠定基礎。 動物的選擇 Ｔ細胞、Ｂ細胞和ＮK細胞缺失但單核細胞發(fā)育正常的重癥聯合免疫缺陷（SCID/Beige）小鼠適合用于CAR-T細胞治療相關CRS研究的動物模型。 造模方法 CAR-T細胞制備：收集健康人群來源的外周血，密度梯度離心法收集外周血單核細胞后，磁珠分選獲得CD3＋T細胞，加入CD3和D28免疫磁珠刺激活化CD3＋T細胞。將包裝好的病毒顆粒按照感染復數為５感染活化后的CD3＋T細胞。感染３ｄ后應用流式細胞儀檢測CAR-T細胞陽性率。 CAR-T細胞功能檢測：將磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS） 組、UTD-D組和CAR-T19組細胞與CD19陽性腫瘤細胞（Nalm-6和Raji）或CD19陰性腫瘤細胞（K562）按不同的效靶比（分別為0:1、1:1、5:1、10:1、20:1）共孵育，流式細胞術雙染法檢測細胞凋亡情況，ELISA分析各組的細胞因子分泌情況（效靶比為20:1）。 ELISA試劑盒檢測小鼠細胞因子分泌：取小鼠血清，96孔板中加入100μl標準品和檢測樣品，室溫于振蕩混勻儀（200rpm）孵育21h，洗板３次后每孔加入100μl 1×檢測抗體，繼續(xù)室溫于振蕩混勻儀（200rpm）孵育1h，完成孵育后，每孔加入100μl 1×Avidin-HRP振蕩混勻儀（200rpm）孵育30min加入3，3′，5，5′⁃四甲基聯苯胺室溫避光顯色10min，加入終止液終止顯色反應（顏色由藍變黃）后立即采用酶標儀檢測450nm波長處吸光度（A）值，依據標準品的濃度及A值于Excel中描述標準曲線，根據標準曲線和樣品A值計算樣品細胞因子濃度。 非抗原特異性Ｔ細胞在SCID/Beige小鼠中誘發(fā)CRS：６～８周齡雌性 SCID/Beige 小鼠６只，分為２組，每組３只。一組經尾靜脈注射人Ｔ細胞（Ｔ細胞組），另外一組經尾靜脈注射人Ｔ細胞和Ｔ細胞活化抗體（OKT-3抗體，Ｔ細胞＋OKT-3抗組），檢測小鼠的體溫、體重和行為活動。注射后0、3、6、12、24 和 36ｈ于小鼠尾靜脈取血，ELISA 試劑盒檢測小鼠血清細胞因子水平的變化。 Raji-Luc2 皮下移植瘤模型的建立及分組：6～8周齡雌性SCID/Beige小鼠９只，分為３組，每組３只。第０天分別通過尾靜脈注射PBS、1×100000個和5×100000個Raji-Luc2細胞，分別記為PBS組、低負荷組和高負荷組，確認成瘤7d后，經尾靜脈注射2×10000000個CAR-T19細胞。 CAR-T19細胞引發(fā)小鼠CRS：注射CAR-T19后，間隔6h測量小鼠體重及體溫的變化，同時尾尖采血，收集在肝素鈉預處理的離心管中，離心半徑8cm，2000r/min離心10min，收集血漿，依據ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清中CRS相關細胞因子人IL-2、人γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、鼠IL-6、人IL-15、鼠粒細胞⁃巨噬細胞集落刺激因子（ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）水平的變化。 Raji-Luc2細胞移植瘤生物發(fā)光區(qū)域及其強度的測量：采用成像系統對SCID/Beige小鼠進行生物發(fā)光成像，運用活體圖像軟件對Raji-Luc2細胞移植瘤發(fā)光區(qū)域及強度進行分析，計算絕對光子數。 結果 CAR-T細胞構建：含4-1BB共刺激結構域的CD19特異性CAR結構（CAR-T１９）由 CD19抗體的單鏈可變區(qū)、CD8跨膜區(qū)、4-1BB胞內區(qū)以及CD3胞內區(qū)組成。慢病毒載體感染后，人CD3+T細胞中CAR陽性率＞30％。 CAR-T19細胞特異性識別 CD19分子：分別將PBS組、UTD-T組和CAR-T19組細胞與CD19陽性腫瘤細胞（Nalm-6 和Raji）或 CD19陰性腫瘤細胞（K562）共孵育，結果顯示，CAR-T19細胞能夠有效靶向 CD19分子并發(fā)揮殺傷作用ELISA結果顯示，在CD19抗原存在時，CAR-T19細胞與Raji、Nalm-6 共孵育組細胞分泌IL-2和IFN-γ的水平均高于K562共孵育組。 PBS組T細胞或CAR-T細胞在無CD19抗原存在時，均未顯示出殺傷活性和細胞因子分泌。表明CAR-T19能夠特異性識別CD19分子，并成功分泌細胞因子IFN-γ和IL-2，從而發(fā)揮殺傷作用。 CAR-T19細胞對Raji腫瘤細胞的殺傷作用：PBS組、低負荷組和高負荷組小鼠成瘤后，第7天經尾靜脈回輸活化后的CAR-T19細胞。在接種腫瘤細胞的第13天，小鼠成像實驗顯示，低負荷和高負荷組小鼠腫瘤熒光強度均低于接種腫瘤的第7天，高負荷組腫瘤熒光強度降低約97%，低負荷組腫瘤熒光強度降低約95%。表明 CAR-T19回輸后，CAR-T19細胞在體內能夠殺傷腫瘤細胞。 CAR-T19細胞殺傷Raji 腫瘤細胞誘發(fā)小鼠體內CRS發(fā)生：荷瘤小鼠注射 CAR-T19細胞72h后，血清中T細胞活化相關細胞因子IL-2、IL-15、IFN-γ水平迅速增高，單核細胞相關因子IL-16、GM-CSF分泌增加，同時伴隨有體溫升高和體重降低等CRS典型特征。小鼠肝、腎、肺組織病理切片HE染色結果顯示，低負荷組、高負荷組小鼠肝、腎、肺組織無明顯損傷。說明CAR-T19胞自身不會引起小鼠CRS，而在接種了高劑量或低劑量Raji細胞的小鼠中，CAR-T19細胞均引起小鼠CRS。 |
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2樓2024-01-09 13:57:30
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