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合肥肽庫(kù)生物

新蟲 (著名寫手)

[交流] 修飾性肽核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

劉春冬, 王建華, 曾芳Chin J Biotech, 2016, 32(3): 292-305
摘要

肽核酸是人工合成的寡核苷酸類似物，以N-(2-氨乙基) 甘氨酸結(jié)構(gòu)單元替代DNA分子中的戊糖-磷酸結(jié)構(gòu)。與天然核酸相比，肽核酸可以更高效地與DNA或RNA特異性雜交，在分子生物學(xué)和基因藥物領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但是，肽核酸骨架呈電中性，難以高效穿過細(xì)胞膜，這成為工程應(yīng)用的最大障礙。為了改善肽核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能，對(duì)肽核酸進(jìn)行化學(xué)修飾是近年來的研究熱點(diǎn)。結(jié)合近十年來文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)室的工作，對(duì)肽核酸的骨架修飾和配合物結(jié)合修飾兩類增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的修飾方法進(jìn)行綜述，并對(duì)修飾性肽核酸細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究中存在的問題以及未來的研究趨勢(shì)及其應(yīng)用提出了見解。

1991年，丹麥哥本哈根大學(xué)生物化學(xué)家Nielsen等[1]通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，首次提出了肽核酸 (Peptide nucleic acid，PNA)，它是一種人工合成的DNA和RNA類似物。在肽核酸分子中，N-(2-氨乙基) 甘氨酸結(jié)構(gòu)單元通過酰胺鍵連接構(gòu)成骨架以替代核酸分子中戊糖-磷酸結(jié)構(gòu)，堿基則通過亞甲羰鍵與骨架仲氨基上的N相連 (圖 1)。這種與天然核酸相似的空間結(jié)構(gòu)使得PNA能以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與DNA或RNA雜交[2]。與天然核酸相比，PNA具有以下優(yōu)點(diǎn)：骨架的柔韌性和電中性使其與DNA或RNA雜交的親和力更高[3]；結(jié)構(gòu)中不含氨基酸殘基或磷酸戊糖單元，因此不受核酸酶或蛋白酶降解，生物穩(wěn)定性高[4]；非手性構(gòu)象便于單體合成和純化[5]；骨架含重復(fù)的酰胺鍵結(jié)構(gòu)，因此可以使用固相合成方法合成寡聚物[6]。

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圖1 圖1 PNA (a) 和DNA (b) 的骨架結(jié)構(gòu)
然而，未修飾PNA在應(yīng)用時(shí)仍存在以下缺點(diǎn)：親水性的結(jié)構(gòu)很難透過細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞攝入差；與靶序列結(jié)合不具備方向性；電中性引起PNA分子自聚集導(dǎo)致水溶性差[7]。其中，PNA的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)難題成為應(yīng)用的最大障礙，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)困難使PNA難以到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，影響了與胞內(nèi)靶點(diǎn)的結(jié)合，降低了生物利用度[8]。因此，增強(qiáng)PNA的細(xì)胞攝入水平是工程應(yīng)用的關(guān)鍵之一。迄今，在這方面取得一定成效的方法可分為以下3類。第一，早期研究主要集中在對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改造，如電致孔法[9]、滲透化細(xì)胞法[10]，該方法基于對(duì)靶細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的修飾，難以適用于PNA工程化應(yīng)用。第二，對(duì)PNA轉(zhuǎn)運(yùn)形式進(jìn)行改造，如與DNA協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)[11]、脂質(zhì)體包埋[12]、納米粒協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)[13]，其中，采用與納米粒共價(jià)連接取得了較好的成效。Bertucci等[14]將PNA共價(jià)連接到L型沸石納米晶體表面，并用生物可降解的聚-L-賴氨酸進(jìn)行包衣，選用Helen Lane細(xì)胞 (HeLa) 考察轉(zhuǎn)運(yùn)情況，結(jié)果表明，該連接復(fù)合物的細(xì)胞攝取率明顯增加。Ma等[15]將PNA與多孔二氧化硅納米顆粒 (Mesoporous silica nanoparticles，MSNP) 通過二硫鍵共價(jià)連接得到PNA-SS-MSNP連接復(fù)合物，在MSNP協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)下，復(fù)合物以內(nèi)吞方式進(jìn)入HeLa細(xì)胞，隨后胞內(nèi)高濃度的谷胱甘肽斷裂二硫鍵，釋放出反義PNA，并有效沉默B細(xì)胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma 2，Bcl-2) 蛋白表達(dá)。McNeer等[16]將聚合物納米粒作為載體加載三聚體PNA，該納米粒能順利轉(zhuǎn)運(yùn)至囊性纖維化支氣管上皮細(xì)胞 (Cystic fibrosis bronchial epithelial cells，CFBE) 內(nèi)，并校正F508del基因突變。第三，對(duì)PNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾。化學(xué)修飾法具有操作方便、形式多樣、適合體內(nèi)研究等優(yōu)點(diǎn)，因此備受關(guān)注。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室研究成果，對(duì)近十年來合成的各種增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能的化學(xué)修飾PNA進(jìn)行綜述，總結(jié)了修飾性肽核酸細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究中存在的問題，并對(duì)未來的研究趨勢(shì)及其應(yīng)用提出了見解。

1 骨架修飾型PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

自PNA提出以后，對(duì)其結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行化學(xué)修飾成為研究重點(diǎn)之一。PNA結(jié)構(gòu)單元的修飾可分為堿基的替換和骨架結(jié)構(gòu)的改造。多數(shù)情況下，堿基替換會(huì)影響PNA的雜交性能，從而降低PNA的生物活性。目前堿基替換研究主要是為了在PNA中引入熒光基團(tuán)，Matarazzo等[17]用吖啶基氨基尿嘧啶替換普通堿基，該基團(tuán)既保留了一定的雜交能力，同時(shí)又具有熒光特性。迄今，有關(guān)堿基替換型PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究不多，Bischof等[18]用含釕一氧化碳釋放分子 (CO-releasing molecules，CORMs) 替換普通堿基，在該基團(tuán)的協(xié)助下，PNA轉(zhuǎn)運(yùn)效率提高，而且自身的CORM特性不會(huì)改變。在PNA結(jié)構(gòu)單元修飾中，骨架修飾是改善PNA細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能的主要措施。骨架修飾指對(duì)PNA的N-(2-氨乙基) 甘氨酸單元結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，骨架修飾PNA在增加水溶性和增強(qiáng)雜交性能方面取得了一定的成功，而且，部分骨架修飾PNA還具備諸如光學(xué)性能、自組裝等特殊優(yōu)點(diǎn)，拓展了PNA的應(yīng)用范圍[19, 20]。在骨架修飾法中，關(guān)鍵是不能影響雜交性能，PNA與DNA或RNA的特異性結(jié)合是PNA大多數(shù)應(yīng)用的前提條件。Hyrup等[21]指出無(wú)論是改變兩個(gè)酰胺鍵之間的骨架長(zhǎng)度，還是改變堿基與氨基之間的骨架長(zhǎng)度都會(huì)降低PNA與DNA或RNA的特異性結(jié)合能力。因此，我們認(rèn)為PNA的骨架修飾應(yīng)遵循不改變基本空間構(gòu)型的原則，可以采取骨架取代修飾或者替換骨架原子構(gòu)成等修飾方法。

1.1 取代骨架上H原子

PNA骨架上有3種類型亞甲基，通過改變亞甲基上取代基團(tuán)的種類，可以得到不同類型的PNA。早期研究以不同α氨基酸為起始原料，合成了多種骨架修飾型PNA，Nielsen等[22]研究了以賴氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸殘基為骨架的修飾型PNA的雜交特性，發(fā)現(xiàn)只有D-賴氨酸的Tm值升高，其他PNA的Tm值均下降。目前，對(duì)亞甲基上H原子的取代是PNA骨架修飾的重要方法。Maison等[23]采用烏吉反應(yīng) (Ugi reaction)，以胺、羧酸、異腈、醛 (或酮) 4種組分為原料發(fā)生縮合反應(yīng)，通過變換各組分結(jié)構(gòu)可以一步合成各種類型的骨架取代PNA (圖 2)。這種取代修飾使得PNA單體成為手性分子，而且各光學(xué)異構(gòu)體的水溶性、雜交性能等往往有差異，通過適當(dāng)篩選，能找到性能更加優(yōu)異的PNA。Mitra等[24]用氨甲基 (Aminomethylene，am) 取代PNA骨架中α位和γ位的H原子，得到了α-S-amPNA、α-R-amPNA和γ-S-amPNA 3種骨架修飾型PNA（圖 3A-C）。通過與特異性結(jié)合的cDNA雜交，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)修飾的PNA相比，α-S-amPNA、α-R-amPNA和γ-S-amPNA的Tm值都相應(yīng)增大，最高增加10 ℃，這表明該結(jié)構(gòu)與DNA特異性結(jié)合能力增強(qiáng)。隨后，選用HeLa細(xì)胞研究了am-PNA進(jìn)入細(xì)胞的能力。結(jié)果表明，3種修飾型am-PNA的細(xì)胞攝入水平都比未經(jīng)修飾的PNA高，而且，其細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力具體表現(xiàn)為：γ位修飾大于α位修飾，R構(gòu)型大于S構(gòu)型。Kumar等[25]用氨丙基取代PNA骨架中γ位的H原子，得到了Cγ-氨基丙烯 PNA (amp-PNA) (圖 3D)。和特異性DNA的雜交實(shí)驗(yàn)表明，與未經(jīng)修飾的PNA相比，其Tm值增大，而且其雜交性能優(yōu)于碳鏈長(zhǎng)度為4的氨丁基PNA。在人乳腺癌細(xì)胞 (Michigan cancer foundation-7，MCF-7) 轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)amp-PNA能高效進(jìn)入該細(xì)胞，并聚集在細(xì)胞核附近。

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圖2 Ugi 4CC法合成PNA單體
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圖3 am-PNA和amp-PNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)
1.2 骨架上引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)

將環(huán)狀結(jié)構(gòu)引入PNA是得到骨架修飾型PNA的重要方法之一，主要選擇較穩(wěn)定的五元環(huán)和六元環(huán)。其中，帶五元環(huán)的PNA因其結(jié)構(gòu)較好地模擬了DNA中戊糖環(huán)，受到人們的重視。合成時(shí)可以選擇自身含有五元環(huán)結(jié)構(gòu)的脯氨酸作為起始原料。Suparpprom等[26]合成了骨架結(jié)構(gòu)為脯氨�；�-2-氨基環(huán)戊羧酸 (Prolyl-2- aminocyclopentanecarboxylic acid，ACPC) 的ACPC-PNA (圖 4A)，這種帶有吡咯烷基的PNA具有很強(qiáng)的剛性結(jié)構(gòu)特性。其中構(gòu)型為 (1S，2S)-ACPC-PNA具有良好的雜交性能，Tm值大于85 ℃，高于相應(yīng)DNA-DNA的Tm值。Merino等[27]合成了含有異惡唑烷結(jié)構(gòu)的Isoxazolidinyl PNA (Isox-PNA) (圖 4B)，該骨架結(jié)構(gòu)可以質(zhì)子化，有利于PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)還具有良好的水溶性。目前，對(duì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)PNA的研究主要涉及提高水溶性和雜交性能，在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面還缺乏研究數(shù)據(jù)。

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圖4 骨架中含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的PNA
1.3 替換骨架上C原子

對(duì)骨架C原子替換具有不改變PNA構(gòu)型的優(yōu)點(diǎn)，通常不會(huì)降低PNA的雜交性能。Kitamatsu等[28]合成了帶有吡咯環(huán)的含氧吡咯烷PNA

(POPNA) 和含氨基吡咯烷PNA (PAPNA) (圖 5)。在POPNA中，O原子替換C原子，即醚鍵代替亞甲基，醚鍵骨架柔韌性更好，與DNA或RNA結(jié)合牢固，其水溶性也相應(yīng)提高。在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (CHO) 中的吸收實(shí)驗(yàn)表明，與甘氨酸骨架PNA相比，其水溶性、雜交特性以及細(xì)胞攝取都得到了改善。在PAPNA中，N原子替換C原子，即叔氨基代替亞甲基，叔氨基可質(zhì)子化，其所帶的陽(yáng)離子電荷有利于跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究表明，由PAPNA組成的寡聚PNA細(xì)胞攝入效率高，但與DNA和RNA的雜交特異性差，而由POPNA組成的寡聚PNA細(xì)胞攝入效率低。將2個(gè)單元PAPNA和7個(gè)單元POPNA聚合形成混合寡聚PNA，發(fā)現(xiàn)雜交特異性和細(xì)胞攝入效率均較好。

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圖5 POPNA (a) 和PAPNA (b) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)
2 PNA連接物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

PNA連接物 (PNA conjugates) 是指將PNA和配體直接共價(jià)結(jié)合，或者通過中介基團(tuán)將兩者共價(jià)連接，得到PNA-配體復(fù)合物。Koppelhus等[29]認(rèn)為，PNA實(shí)現(xiàn)工程應(yīng)用的前提之一是其自身分子能高效通過細(xì)胞膜。我們認(rèn)為諸如細(xì)胞微注射法、電穿孔法和電滲透法雖然轉(zhuǎn)運(yùn)效率較高，但在體內(nèi)使用受限，不適合臨床應(yīng)用。對(duì)PNA分子結(jié)構(gòu)的整體修飾，尤其是尋找合適的配體，制備跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能優(yōu)越的PNA連接物是一種有效的手段。以配體共價(jià)修飾制備連接物的方法不僅具備高效的細(xì)胞傳遞性能，而且在雜交性能、細(xì)胞毒性等方面具有一定優(yōu)勢(shì)，具有工程應(yīng)用的潛力。近年來，對(duì)PNA分子進(jìn)行整體修飾，尋找合適的配體，取得了一些成功的研究成果，這也可能是今后將PNA工程化開發(fā)研究的一個(gè)趨勢(shì)。

2.1 PNA-CPP連接物

目前，在種類眾多的PNA連接物中，使用最廣泛的是PNA-CPP。細(xì)胞穿透肽 (Cell penetrating peptide，CPP) 是一類能攜帶各種類型大分子物質(zhì)穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的多肽。一般為帶正電荷的長(zhǎng)短不一的短肽，富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，正電荷特性有助于與細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)結(jié)合[30]。CPP作為引導(dǎo)物質(zhì)已廣泛應(yīng)用于DNA、RNA以及藥物分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，借鑒這些經(jīng)驗(yàn)，將CPP引入PNA傳遞體系，取得了較好的成效。細(xì)胞對(duì)PNA-CPP共價(jià)連接物主要通過類似胞吞的內(nèi)化作用，使PNA成功進(jìn)入胞漿的泡囊中。表 1和表 2總結(jié)了近十年來在PNA轉(zhuǎn)運(yùn)體系普遍采用且有效的CPP，主要有以下6種：1) 單聚精氨酸和賴氨酸類 (Simple oligoarginines and oligolysines)；2) HIV反式激活蛋白 (HIV transactivator protein，Tat)；3) 核定位序列 (Nuclear localization signal，NLS)；4) (KFF)3K；5) M918；6) 信號(hào)肽 (Signal peptide)。

表1 用于轉(zhuǎn)運(yùn)的PNA-CPP連接物
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表2 CPP的氨基酸序列
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研究表明，各種富含精氨酸和賴氨酸的多肽具有細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)活性，雖然它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)各異，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理既不同于細(xì)胞膜內(nèi)吞作用，也不同于細(xì)胞表面受體結(jié)合作用[40]。一般認(rèn)為，氨基酸殘基數(shù)目對(duì)PNA轉(zhuǎn)運(yùn)活性有顯著影響，具有較好轉(zhuǎn)運(yùn)效率的殘基數(shù)為5到12個(gè)。Bendifallah等[33]考察了精氨酸殘基數(shù)的影響情況，發(fā)現(xiàn)PNA-Arg9連接物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率大于 Arg7和 Arg8，他們認(rèn)為適當(dāng)增加氨基酸殘基數(shù)可以提高PNA-Arg的細(xì)胞攝入。另一種常用的單聚多肽是聚賴氨酸，Albertshofer等[32]發(fā)現(xiàn)連接八聚L-賴氨酸的PNA能高效通過鼠BCL1細(xì)胞膜。1988年，人們首次發(fā)現(xiàn)了Tat反式激活蛋白穿透細(xì)胞膜的功能，之后被應(yīng)用于諸如β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶等各種大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[41]。Folini等[34]將PNA與Tat共價(jià)連接，發(fā)現(xiàn)連接物能順利進(jìn)入DU145癌細(xì)胞，并與胞內(nèi)特定mRNA特異性結(jié)合，該連接物與其他傳遞方法相比有效地提高了PNA的生物利用度。Su等[35]采用固相合成法合成了PNA-AEEA-Tat連接物，并以濃度依賴方式高效地進(jìn)入了3T3細(xì)胞。NLS能與核載體相互作用，主要應(yīng)用于將大分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。有研究發(fā)現(xiàn)NLS也能促進(jìn)PNA的細(xì)胞攝入水平，Joshi 等[36]將NLS共價(jià)連接到PNA上，并研究了它們進(jìn)入細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的情況，發(fā)現(xiàn)連接物轉(zhuǎn)運(yùn)效率是未經(jīng)修飾PNA的2倍。但是，Bendifallah等[33]將NLS與其他引導(dǎo)化合物進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)PNA-NLS的轉(zhuǎn)運(yùn)效率不是很好。(KFF)3K也是一種常用的引導(dǎo)化合物。Ghosal等[37]分別研究了D型和L型的(KFF)3K協(xié)助PNA進(jìn)入細(xì)胞情況，發(fā)現(xiàn)只有L型的L((KFF)3K)具有很好的效果，而同樣序列的D型多肽沒有促進(jìn)PNA的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。M918是一種含有22個(gè)氨基酸殘基的多肽，富含精氨酸。Lee等[38]在HT-29-luc細(xì)胞中研究了PNA-M918連接物的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況，發(fā)現(xiàn)該連接物能有效地進(jìn)入細(xì)胞，并特異性沉默相應(yīng)基因。而且在高達(dá)25 umol/L 濃度下，M918既不會(huì)損傷細(xì)胞膜，也不會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，非常適合體內(nèi)應(yīng)用。信號(hào)肽可以直接引導(dǎo)蛋白質(zhì)穿過真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和原核細(xì)胞的內(nèi)膜，其序列往往包含由疏水氨基酸殘基構(gòu)成的疏水核。研究表明信號(hào)肽的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)作用主要是由于其疏水區(qū)域和細(xì)胞膜上雙分子層脂質(zhì)的相互作用，Li等[39]認(rèn)為這種相互作用要求信號(hào)肽的氨基酸殘基數(shù)為5到15個(gè)。他們將一種15個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽及兩種類似多肽分別連接到含10個(gè)胸腺嘧啶堿基的PNA的N末端，并研究了3種連接物進(jìn)入紅細(xì)胞的情況，結(jié)果表明3種連接物都增強(qiáng)了PNA的細(xì)胞攝入水平，而且十五肽的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)效率最好；但是十五肽連接物的水溶性差，而另外兩種六肽和十肽連接物的水溶性較好。
2.2 PNA-親脂性配體連接物
PNA與疏水性化合物或類脂共價(jià)結(jié)合所形成的連接物具有某些優(yōu)異的特性。例如，在PNA的N末端連接疏水性長(zhǎng)碳鏈，在C末端連接氨基酸殘基，該連接物具有良好的親水親油性，與DNA雜交時(shí)表現(xiàn)出更好特異性[42]。該連接物還可自組裝成球形膠束，在生物傳感器、基因藥物等方面具有應(yīng)用潛力[43]。而且PNA-親脂性配體連接物在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面也顯示出很好的性能。表 3總結(jié)了近十年來成功用于PNA轉(zhuǎn)運(yùn)的親脂性配體化合物。
表3 用于轉(zhuǎn)運(yùn)的PNA-親脂性配體連接物
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親脂性配體中適合于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的一類物質(zhì)是具有一定親水親油平衡值的類脂，在跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，親水一端朝向胞外水溶性環(huán)境，而疏水一端則朝向細(xì)胞膜并與細(xì)胞膜作用。這種修飾典型代表是膽酸和膽固醇共價(jià)連接PNA，該連接物在體內(nèi)還具有一定的肝臟靶向作用，具有開發(fā)成肝臟靶向制劑的潛力[44]。Shiraishi等[44]將PNA通過半琥珀酸酯鍵與膽固醇或膽酸結(jié)合，并在HeLa pLuc705細(xì)胞中對(duì)復(fù)合物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明所得到的復(fù)合物高效地通過細(xì)胞膜，而且PNA-膽酸復(fù)合物的水溶性更好。Joshi等[45]將PNA與膽固醇通過賴氨酸連接，制備了一種高效的磁共振造影劑，其轉(zhuǎn)運(yùn)性能和DNA特異性結(jié)合性能都很好。此外，疏水性較強(qiáng)的芳雜環(huán)化合物與PNA結(jié)合也顯示出較好的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。Shiraishi等[46]研究了多種芳雜環(huán)化合物修飾PNA及其細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況，這些芳雜環(huán)化合物包括吖啶、苯并咪唑、咔唑、蒽醌、芘、卟啉、萘嵌間二氮雜苯、煙酸己可堿、紫菜堿、補(bǔ)骨脂等，并采用HeLa pLuc705和p53R細(xì)胞考察這些PNA連接物的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。結(jié)果表明，芳雜環(huán)化合物具有普遍增強(qiáng)PNA轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，其中吖啶和煙酸已可堿與PNA形成的連接物活性最高。但是，目前還不清楚芳雜環(huán)的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運(yùn)活性之間的關(guān)系。另一類適用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)的親脂性配體是聚合物，在PNA中成功應(yīng)用的有聚磷酸酯、聚乙烯胺 (PEI)、聚乙二醇 (PEG) 等。Shiraishi等[47]合成了聚合度分別為3、7、10的PNA-聚谷氨酰胺磷酸酯和聚合度分別為4、5、6的PNA-聚賴氨酸二磷酸酯PNA連接物，并在HeLa pLuc705細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，將聚磷酸酯共價(jià)連接在PNA上顯著地增強(qiáng)了PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，而且不影響其雜交特異性和親和性。此外，磷酸酯的數(shù)目對(duì)PNA的轉(zhuǎn)運(yùn)有影響，六聚賴氨酸二磷酸酯連接物的活性最強(qiáng)，與未修飾PNA相比，其細(xì)胞攝取率可增加20倍。Berthold等[48]將PNA通過二硫鍵與聚乙烯胺連接得到PNA-PEI復(fù)合物，并在HeLa pLuc705細(xì)胞中進(jìn)行細(xì)胞傳遞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，PEI可以作為PNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的高效引導(dǎo)物，而且不受胞內(nèi)溶酶體的影響。
上述親脂性配體中，諸如膽固醇、聚磷酸酯、PEI、PEG等都屬于陽(yáng)離子型轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)。Llovera等[49]指出陽(yáng)離子型連接物與細(xì)胞膜表面親和力強(qiáng)，而PNA細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率與細(xì)胞表面PNA濃度密切相關(guān)，這是上述配體具有高效轉(zhuǎn)運(yùn)性能的重要原因之一。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，前文所述的PAPNA、Isox-PNA、am-PNA、amp-PNA以及CPP都具有帶正電荷性質(zhì)，其轉(zhuǎn)運(yùn)性能也與自身所帶正電荷相關(guān)。因此我們認(rèn)為，在今后合成PNA新單體和尋找新配合物中，為了提高PNA轉(zhuǎn)運(yùn)性能，可以考慮將引入帶正電荷基團(tuán)作為一種有效的措施。
2.3 PNA-功能性配體連接物
近年來，將PNA開發(fā)成基因藥物是研究熱點(diǎn)之一，然而導(dǎo)致PNA成藥性差的最大障礙依然是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)難題。將PNA與合適的具有藥理活性的功能性配體共價(jià)連接是PNA藥物開發(fā)中的一種成功嘗試。PNA-功能性配體連接物的成功設(shè)計(jì)不僅改善了PNA的細(xì)胞攝入水平，同時(shí)也將功能性配體化合物導(dǎo)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)PNA和功能性配體雙重治療作用。該連接物中，配體不僅僅具有協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)的作用，還能發(fā)揮自身藥理活性。表 4總結(jié)了近年來研究的具有增強(qiáng)PNA轉(zhuǎn)運(yùn)的功能性配體化合物。
表4 用于轉(zhuǎn)運(yùn)的PNA-功能性配體連接物
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本實(shí)驗(yàn)室在PNA-功能性配體連接物方面做了一些研究工作，王建華[50, 51]研究了PNA與氟尼辛和阿司匹林的共價(jià)連接物的合成方法，
所得到的兩種連接物具有良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能。氟尼辛是一種非甾體抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥，主要治療病毒性感染引起的豬無(wú)名高熱綜合征和急性高熱炎癥。本實(shí)驗(yàn)室制備的PNA-弗尼辛連接物在用量為2 mg/kg時(shí)，仔豬的體溫降低值為0.56 ℃；而單獨(dú)使用弗尼辛用量為4 mg/kg時(shí)，仔豬的體溫降低值為0.57 ℃；單獨(dú)使用PNA用量為10 mg/kg時(shí)，仔豬的體溫降低值為0.74 ℃。PNA與氟尼辛共價(jià)連接所合成的連接物對(duì)豬高熱病混合感染引起的疾病具有顯著治療效果，而且效果比單獨(dú)使用PNA或者氟尼辛好。阿司匹林是一種歷史悠久的解熱鎮(zhèn)痛藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕、抗血小板凝集以及提高免疫力等藥理作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，分別將阿司匹林、PNA和PNA-阿司匹林連接物給藥4周后，體內(nèi)白細(xì)胞水平分別為 (22.9±3.7)×109/L、(23.1±4.6)×109/L和(26.2±2.9)×109/L；免疫球蛋白G濃度分別為 (53.69±8.97) mg/mL、(47.12±4.53) mg/mL、(62.36±9.58) mg/mL；超氧化物歧化酶濃度分別為(23.99±1.26) μg/mL、(18.02±2.45) μg/mL、(29.60±1.78) μg/mL。PNA-阿司匹林連接物能明顯提高生物體內(nèi)白細(xì)胞、免疫球蛋白G和超氧化物歧化酶水平，可用于制備免疫增強(qiáng)劑，應(yīng)用前景較好。
具有較好細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能的PNA-功能性配體連接物還有以下幾種。Bendifallah等[52]提出了一種連接PNA與功能性配體的2-([N-Boc-氨基乙酸]甲氧基) 苯甲酸酯鍵結(jié)構(gòu)，通過該酯鍵結(jié)構(gòu)將PNA與金剛烷共價(jià)連接得到PNA-酯鍵-金剛烷連接物。通過IMR-90細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)和HeLa pLuc705細(xì)胞的反義活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該連接物能順利進(jìn)入IMR-90細(xì)胞并在細(xì)胞核附近聚集，其反義活性有一定的提高，但不太顯著。該連接物另一特性是結(jié)構(gòu)中的酯鍵在體外穩(wěn)定；而在體內(nèi)，由于酶的作用，穩(wěn)定性下降 2 000-3 000倍。因此，PNA-酯鍵-金剛烷連接物在體內(nèi)能分解為PNA和金剛烷，這種酯鍵結(jié)構(gòu)具有開發(fā)成“前藥”的潛力。Das等[53]發(fā)現(xiàn)PNA與新霉素的連接物具有良好的細(xì)胞攝入水平，而且，減少氨基基團(tuán)數(shù)目，得到的PNA-氨基葡萄糖胺連接物的轉(zhuǎn)運(yùn)效果更好。新霉素是一種氨基糖苷類抗生素，通過與16S rRNA結(jié)合，導(dǎo)致 mRNA編碼錯(cuò)誤，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。將6-氨基葡萄糖胺環(huán)與HIV-1 TAR RNA互補(bǔ)的十六聚PNA連接，所得到的連接物與靶序列結(jié)合牢固，而且在被HIV-1感染的細(xì)胞中，有效地抑制了病毒復(fù)制，而在同樣條件下，未修飾PNA很難進(jìn)入細(xì)胞。Browne等[54]將PNA以不同的方式與兩種維生素E連接，其中一種帶有長(zhǎng)碳鏈，得到的連接復(fù)合物中部分具有較好的雜交特性，并且提高了PNA的細(xì)胞攝入水平和生物利用度。而且維生素E自身是一種特高免疫力的藥物，具有清除體內(nèi)自由基、抗衰老的功能。因此，這種連接物不但不會(huì)有細(xì)胞毒性，而且還具有PNA與維生素E的協(xié)同治療的潛在應(yīng)用。
3 結(jié)語(yǔ)與展望
PNA自1991年提出以來，由于具有優(yōu)異的雜交性能、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)特性及方便有效的合成方法受到重視，隨著各種新單體的成功合成和寡聚體修飾的研究，PNA的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展。早期作為分子生物學(xué)工具，在基因檢測(cè)、醫(yī)療診斷和生物傳感器等方面取得了較好的應(yīng)用。近年來，對(duì)PNA的研究的熱點(diǎn)之一轉(zhuǎn)向基因治療，通過對(duì)PNA的修飾與改造，開發(fā)PNA反義藥物的潛力。目前，PNA在反義藥物方面應(yīng)用的最大障礙是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)差，并導(dǎo)致生物利用度低，成藥性差。
為提高PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，包括細(xì)胞膜改造、骨架修飾、配體修飾等方法的成功應(yīng)用，在改善PNA細(xì)胞攝入水平差的難題上已取得了一定進(jìn)展，部分地解決了這些問題。但是，目前的研究主要處于體外細(xì)胞水平，PNA在生物體內(nèi)的吸收、代謝及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)方面還有待于進(jìn)一步探討。迄今還沒有PNA藥物進(jìn)入臨床研究階段，這與PNA的生物利用度和細(xì)胞毒性等方面的缺陷，以及缺乏體內(nèi)研究數(shù)據(jù)有關(guān)。
今后，改善PNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能是研究的重點(diǎn)之一。我們認(rèn)為對(duì)PNA自身結(jié)構(gòu)的修飾在成藥性方面比細(xì)胞膜滲透法和電致孔法更為有效，開發(fā)適合的骨架結(jié)構(gòu)和尋找有效的配體引導(dǎo)化合物可能是促進(jìn)PNA在反義藥物方面取得突破的一項(xiàng)重要工作。目前，已報(bào)道的骨架修飾型PNA大約有幾十種，從水溶性、雜交性能、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)性能等篩選指標(biāo)出發(fā)，部分骨架修飾PNA具有較好的應(yīng)用前景。同時(shí)，PNA的雜交性能與骨架空間構(gòu)型密切相關(guān)，對(duì)PNA骨架進(jìn)行修飾應(yīng)在保持其骨架基本構(gòu)型不變的基礎(chǔ)上進(jìn)行。這給PNA的骨架修飾提出了較為苛刻的要求，并在一定程度上限制了骨架修飾型PNA的結(jié)構(gòu)變化。而通過選擇合適的配體，與PNA共價(jià)連接形成PNA-配體連接物不改變PNA自身特性，但賦予PNA在諸如細(xì)胞毒性、藥理活性以及細(xì)胞攝取率等方面更優(yōu)異的性能，具有更好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室將抗病毒藥物和增強(qiáng)免疫力藥物與PNA寡聚體N末端共價(jià)連接，動(dòng)物臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PNA-藥物連接物治療效果更好。同時(shí)，我們認(rèn)為可以在以下幾方面作嘗試：第一，將PNA骨架修飾與配體連接物修飾結(jié)合，首先合成具有良好轉(zhuǎn)運(yùn)潛力的骨架修飾單體PNA，在聚合時(shí)，在寡聚體末端或中間引入引導(dǎo)配體，綜合利用兩種修飾的優(yōu)點(diǎn)；第二，將PNA修飾物與制劑開發(fā)手段結(jié)合，如采用脂質(zhì)體、納米粒等制劑新技術(shù)協(xié)助修飾型PNA轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)PNA的臨床應(yīng)用；第三，開發(fā)具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能性化合物，如前所述，維生素E、阿司匹林、氟尼辛等藥物既可作為PNA轉(zhuǎn)運(yùn)引導(dǎo)化合物，同時(shí)自身又具有特定的藥理活性，這種PNA連接物具有雙重治療的優(yōu)異性能。
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