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細(xì)胞穿膜肽研究應(yīng)用的新進(jìn)展
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謝洋洋, 王邵娟, 袁權(quán), 等. Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(7): 1162-1173. 摘要 細(xì)胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)是一類能夠穿過細(xì)胞膜或組織屏障的短肽。CPPs可通過內(nèi)吞和直接穿透等機(jī)制運(yùn)載蛋白質(zhì)、RNA、DNA等生物大分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其效應(yīng)功能。相比于其他非天然的化學(xué)分子，CPPs具有生物相容性佳、對細(xì)胞造成的毒性小、完成入胞轉(zhuǎn)運(yùn)后可降解、并能與生物活性蛋白直接融合重組表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因此成為以胞內(nèi)分子為靶標(biāo)的藥物遞送技術(shù)發(fā)展的重要工具，并在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。文中針對CPPs的分類特點(diǎn)、入胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及其治療應(yīng)用的新近研究進(jìn)展進(jìn)行綜述和討論。 以單克隆抗體(Monoclonal antibodies，mAbs)為代表的生物大分子藥物以其靶向特異性和高效性在惡性腫瘤、自身免疫病等重大疾病的治療中發(fā)揮了重要作用。但是，單抗類藥物由于分子量大，超過了Lipinski規(guī)則的限制[1]，不能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，只能用于識別和靶向細(xì)胞表面靶標(biāo)和分泌性蛋白靶標(biāo)。然而，人類細(xì)胞中位于細(xì)胞膜表面的蛋白和能夠分泌到細(xì)胞外的蛋白編碼基因僅為6 000–7 000個(gè)，僅占全部編碼基因的20%不到，大量潛在的疾病治療靶標(biāo)位于細(xì)胞內(nèi)部，不能使用蛋白分子進(jìn)行靶向干預(yù)，極大地限制了單抗的應(yīng)用范圍。此外，基因治療等新興治療技術(shù)也需要解決核酸(DNA、RNA)等生物大分子的細(xì)胞導(dǎo)入問題。因此，藥物無法到達(dá)指定的細(xì)胞且進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是生物大分子藥物進(jìn)一步拓展應(yīng)用可及性的主要障礙。多年來，研究者發(fā)展了多種可使生物大分子藥物穿過細(xì)胞膜的入胞轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)，主要包括顯微注射技術(shù)、電穿孔技術(shù)、脂質(zhì)體和基于病毒的載體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)。此類技術(shù)已經(jīng)能較好地實(shí)現(xiàn)核酸大分子的體內(nèi)外入胞，但并不適用于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，此外還存在入胞效率低、細(xì)胞毒性、特異性差等缺點(diǎn)。1988年，兩個(gè)獨(dú)立研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)中的反式轉(zhuǎn)錄激活因子(Transactivator, TAT)，能夠有效穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[2]。1994年，英國劍橋大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)證明了融合表達(dá)TAT的蛋白能夠被有效導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)，并且不受細(xì)胞類型的限制[3]。隨后，許多不同種類的具有穿越細(xì)胞膜能力的蛋白被發(fā)現(xiàn)，并被命名為細(xì)胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)[4]。細(xì)胞穿膜肽通常是不超過30個(gè)氨基酸的多肽分子，能夠不依賴特異膜受體獨(dú)立穿過細(xì)胞膜，甚至有些細(xì)胞穿膜肽的入胞并不依賴能量[5]。由于細(xì)胞穿膜肽的多肽屬性，進(jìn)入細(xì)胞后能被正常分解，具有較好的生物相容性，通常對細(xì)胞毒性較小。穿膜肽介導(dǎo)的生物大分子藥物的入胞研究在之后蓬勃發(fā)展。經(jīng)過近30年的發(fā)展，細(xì)胞穿膜肽從被發(fā)現(xiàn)到基礎(chǔ)研究走向了臨床藥物的研發(fā)。目前，細(xì)胞穿膜肽已經(jīng)成為生物分子穿過細(xì)胞膜從而進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)囊粋�(gè)強(qiáng)大載體工具[6]。近來，隨著抗體在細(xì)胞內(nèi)靶向和免疫功能的進(jìn)一步揭示，利用穿膜肽遞送具有活性的抗體片段(Fab和ScFv等)以靶向細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)正成為研究的熱點(diǎn)。近期筆者團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究也證實(shí)了TAT融合表達(dá)識別乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV) HBx蛋白的全分子抗體IgG能夠有效進(jìn)入細(xì)胞，并經(jīng)由TRIM21介導(dǎo)的蛋白降解HBx，進(jìn)而在細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中發(fā)揮顯著的抗HBV作用[7]。各種細(xì)胞穿膜肽衍生肽療法的臨床前評估取得了重大成就，多家世界著名的制藥公司正在進(jìn)行臨床開發(fā)工作，這也從側(cè)面反映出細(xì)胞穿膜肽臨床應(yīng)用具有強(qiáng)大的潛力。 1 細(xì)胞穿膜肽的分類 根據(jù)細(xì)胞穿膜肽的序列、來源、功能和入胞機(jī)制等特點(diǎn)都可以對其進(jìn)行分類，目前學(xué)界尚無統(tǒng)一分類標(biāo)準(zhǔn)。相對通行的分類方法是根據(jù)細(xì)胞穿膜肽的物理化學(xué)性質(zhì)將其分為3類：陽離子型、兩親型和疏水型，如表 1所示。 圖片 表 1 已報(bào)道的部分穿膜肽序列及分類特點(diǎn) 1.1 陽離子型細(xì)胞穿膜肽 陽離子型的細(xì)胞穿膜肽通常具有較高的凈正電荷數(shù)。首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的穿膜肽TAT就是一種典型的陽離子型的穿膜肽。常見的陽離子型的細(xì)胞穿膜肽還有源于乙酰肝素結(jié)合蛋白的DPV1047等一系列DPV穿膜肽[8]，源于RNA結(jié)合蛋白的HIV-1 Rev、BMV Gag酵母Prp6以及源于DNA結(jié)合蛋白的Protamine1和Penetratin[9]。大多數(shù)的陽離子型的細(xì)胞穿膜肽富含精氨酸和賴氨酸，2002年P(guān)ark的研究表明TAT蛋白起到穿膜作用的最小結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?9–57位的氨基酸序列TAT49-57，這個(gè)由9個(gè)氨基酸序列組成的穿膜肽含有6個(gè)精氨酸[10]。對于多精氨酸類型的細(xì)胞穿膜肽的研究顯示，即使是簡單的多聚精氨酸序列組成的穿膜肽也具有穿膜能力，比如R5、R7、R9和R11[11]，并且其穿膜能力與所含精氨酸數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)[12]。一些陽離子型的細(xì)胞穿膜肽也含有多個(gè)賴氨酸殘基。研究表明，多聚賴氨酸也具有一定的穿膜功能，但其穿膜能力通常比多聚精氨酸型的要差。Wender及其合作者的研究中闡釋了在富含精氨酸的細(xì)胞穿膜肽中多個(gè)胍基團(tuán)的存在對于膜穿透性能力發(fā)揮了關(guān)鍵的作用：精氨酸的胍基與細(xì)胞膜中帶負(fù)電荷的羧酸、磷酸基團(tuán)能夠相互作用形成氫鍵，從而穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)[13-15]。雖然賴氨酸和精氨酸有相同的凈正電荷數(shù)，但前者不含有胍基，所以穿膜能力不佳。同時(shí)Lindgren和Langel的研究認(rèn)為精氨酸的數(shù)量和排列順序?qū)τ诖┠る牡拇┠つ芰τ兄匾挠绊慬16]。雖然精氨酸在陽離子型的細(xì)胞穿膜肽中有著決定性的作用，其他的氨基酸殘基在陽離子型的細(xì)胞穿膜肽中也并非可有可無的，例如在Penetratin穿膜肽中將第14位的色氨酸殘基突變成苯丙氨酸后將使其喪失穿膜能力[17]。 1.2 兩親型細(xì)胞穿膜肽 兩親型的細(xì)胞穿膜肽通常同時(shí)包含極性基團(tuán)和非極性基團(tuán)，從而同時(shí)具備親水性和疏水性。大部分的兩親型細(xì)胞穿膜肽含有較多的正電荷，其電荷貢獻(xiàn)主要來源于廣泛分布的賴氨酸和精氨酸，但它們和陽離子型的細(xì)胞穿膜肽的區(qū)別在于：決定其具備入胞功能的機(jī)制并不是因?yàn)樗鼈兊恼娀鶊F(tuán)而是它們的兩親性[18]。MAP、Transportan和Pep-1都屬于兩親型細(xì)胞穿膜。兩親型細(xì)胞穿膜肽又可以進(jìn)一步細(xì)分為一級結(jié)構(gòu)兩親型、二級結(jié)構(gòu)兩親型和富含脯氨酸兩親型[18]。許多一級結(jié)構(gòu)的兩親型細(xì)胞穿膜肽是將一些蛋白的疏水結(jié)構(gòu)域和核定位信號肽(NLS)相連接組成。例如MPG是由SV40 NLS (PKKRKV)和源于HIV糖蛋白41的疏水序列(GALFLGFLGAAGSTMGA)組成，以及Pep-1是由富含色氨酸的序列(KETWWETWWTEW)和SV40 NLS (PKKRKV)組成。還有一些穿膜肽如Bovine Prp[19]、ARF[20]、pVEC[21]也屬于一級結(jié)構(gòu)兩親型，但它們是完全源于天然的蛋白。二級結(jié)構(gòu)兩親型細(xì)胞穿膜肽主要包括α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)兩親型。在α-螺旋結(jié)構(gòu)中，兩性基團(tuán)分別存在于α-螺旋的兩面，通常這種類型的細(xì)胞穿膜肽在肽鏈一端含有一個(gè)高度疏水的基團(tuán)，在另一端可能是正電、負(fù)電或者極性基團(tuán)。目前只有一種β-折疊類型的兩親型細(xì)胞穿膜肽VT5 (DPKGDPK GVTVTVTVTVTGKGDPKPD)，對于VT5的研究表明這個(gè)穿膜肽形成β-折疊結(jié)構(gòu)對其穿膜功能是必不可少的[22]。富含脯氨酸和多聚脯氨酸兩親型穿膜肽在肽鏈中含有大量的脯氨酸。如SAP[23]，來源于γ-玉米蛋白(γ-zein)，其序列含有50%的脯氨酸。Bac7[24]和(PRR)n (n=3，4，5，6)[25]也屬于這一類。脯氨酸的結(jié)構(gòu)在20種天然氨基酸中比較特別，因其較為特殊的吡咯烷環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)在氨基酸序列中大量存在時(shí)能夠形成一種稱為Ⅱ型多聚脯氨酸(PolyprolineⅡ，PPⅡ)的二級結(jié)構(gòu)，可能與其穿膜能力有關(guān)。 1.3 疏水型細(xì)胞穿膜肽 疏水型細(xì)胞穿膜肽通常只含有非極性基團(tuán)，因此具有較低的凈電荷數(shù)。它們的疏水性基團(tuán)在穿膜過程中發(fā)揮著重要的作用。相比于上述提到的兩種類型(陽離子型和兩親型)的穿膜肽，疏水型穿膜肽的目前報(bào)道發(fā)現(xiàn)數(shù)量相對較少，且尚不清楚其入胞機(jī)制。常見的疏水型細(xì)胞穿膜肽有BIP[26]、C105Y[27]、Pep-7[28]、SG3和FGF[18]等。它們含有60%以上的非極性基團(tuán)，并且凈電荷在−2到+1之間。 2 細(xì)胞穿膜肽的入胞機(jī)制 細(xì)胞穿膜肽如何運(yùn)載蛋白或其他分子從細(xì)胞外部轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部，最終到達(dá)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的機(jī)制近年來已有較多研究進(jìn)展，但仍不完全清晰，一些模型和假說還存在一定爭議[29]。通常認(rèn)為，細(xì)胞穿膜肽可能通過多種不同途徑進(jìn)入胞內(nèi)，這些入胞途徑可以大致被分為兩類，細(xì)胞內(nèi)吞(Endocytosis)途徑和直接穿透(Direct penetration)途徑[30]。要區(qū)分這兩種入胞途徑技術(shù)上并不困難，熒光標(biāo)記的細(xì)胞穿膜肽通過直接穿透途徑進(jìn)入細(xì)胞后，胞內(nèi)的熒光應(yīng)該是均勻擴(kuò)散的；而通過內(nèi)吞作用進(jìn)入到細(xì)胞的穿膜肽，因?yàn)槟遗莸陌�，胞�?nèi)的熒光應(yīng)該是呈現(xiàn)點(diǎn)狀的分布。但要精確定義某種穿膜肽的穿膜途徑并沒有那么簡單，即使是同一種穿膜肽，穿膜效率和途徑也會(huì)受其濃度、溫度、細(xì)胞種類的影響而改變。例如隨使用濃度的增加，TAT和R8類穿膜肽在Hela細(xì)胞中的穿膜途徑逐漸由內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯哟┩讣?xì)胞膜[31]。R8進(jìn)入KG1a懸浮細(xì)胞在溫度調(diào)節(jié)下具有類似的效應(yīng)：在37 ℃時(shí)主要通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，而當(dāng)溫度低于20 ℃時(shí)，其能以直接穿透的方式進(jìn)入胞內(nèi)[32]。說明部分穿膜肽可能具有多種細(xì)胞穿膜途徑以應(yīng)對不同的環(huán)境。細(xì)胞穿膜肽的內(nèi)化機(jī)制將取決于：肽及底物的性質(zhì)；細(xì)胞類型、融合度、細(xì)胞活力以及質(zhì)膜和細(xì)胞外基質(zhì)的組成；溫度、離子強(qiáng)度和pH等環(huán)境因素。 2.1 細(xì)胞內(nèi)吞(Endocytosis)途徑 在多數(shù)細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的入胞實(shí)驗(yàn)中，通常通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞內(nèi)[33]。細(xì)胞內(nèi)吞途徑通常又可細(xì)分為巨胞飲作用(Macropinocytosis)、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(Clathrin-dependent endocytosis)、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(Caveolin- dependent endocytosis)以及網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴的內(nèi)吞作用(Clathrin/caveolin-independent endocytosis) (圖 1)[34]。細(xì)胞穿膜肽的內(nèi)吞機(jī)制可能涉及上述提到的多種途徑。研究穿膜肽的內(nèi)吞機(jī)制可以通過使用抑制劑針對性地阻遏某種特定的內(nèi)吞途徑評估是否對其入胞有重要影響。Soraj等利用多種內(nèi)吞途徑的藥物抑制以及siRNA對內(nèi)吞途徑中關(guān)鍵蛋白的敲低，研究對R8和TAT在Hela和A431細(xì)胞系中的入胞效果。對網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑以及網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白非依賴的內(nèi)吞作用的單獨(dú)抑制都不能對入胞產(chǎn)生明顯的影響，只有對巨胞飲作用的抑制能夠大幅降低R8和TAT的入胞效率，因此推斷巨胞飲作用是R8和TAT的入胞轉(zhuǎn)運(yùn)中最主要的內(nèi)化途徑。巨胞飲是精氨酸富集的細(xì)胞穿膜肽內(nèi)化機(jī)制的典型形式[35]，其中肌動(dòng)蛋白(Actin)起著重要作用，穿膜肽與細(xì)胞膜作用導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白的重新排列，可導(dǎo)致細(xì)胞膜表面許多地方形成向下凹陷的結(jié)構(gòu)，這些凹陷的膜結(jié)構(gòu)隨后形成一個(gè)巨大的巨胞飲小體(Macropinosomes)。其直徑比其他內(nèi)吞途徑產(chǎn)生的囊泡直徑都要大的多，更適合大分子和納米顆粒的入胞[36]。有研究發(fā)現(xiàn)穿膜肽可通過激活蛋白激酶B從而激活巨胞飲作用，并且細(xì)胞膜上的乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)可能作為受體與細(xì)胞穿膜肽相互作用促進(jìn)了RAC蛋白的激活。多配體聚糖(Syndecans)可能也參與了這個(gè)過程[37]。巨胞飲作用容易受外部刺激誘導(dǎo)，特別是一些生長因子如表皮生長因子，其在癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中很常見[38]。這將有利于穿膜肽介導(dǎo)抗癌藥物的遞送。Tanaka等發(fā)現(xiàn)R12的細(xì)胞攝取和巨胞飲作用的誘導(dǎo)依賴于趨化因子受體CXCR4，但對于CXCR4的抑制并不會(huì)對R8和TAT的巨胞飲途徑有很大的影響[39]。因此，穿膜肽的內(nèi)吞作用機(jī)制中，膜受體可能也發(fā)揮著重要的作用，并且可能有更多的受體或蛋白參與到這個(gè)機(jī)制中。雖然巨胞飲作用是穿膜肽內(nèi)吞攝取中的關(guān)鍵機(jī)制之一，但由于之前的研究都是使用的癌細(xì)胞系，其在原代細(xì)胞和體內(nèi)的入胞機(jī)制是否與腫瘤細(xì)胞存在差異還需進(jìn)一步研究證明。 圖片 圖 1 細(xì)胞內(nèi)吞途徑 2.2 直接穿透(Direct penetration)機(jī)制 相比于細(xì)胞穿膜肽的內(nèi)吞途徑，直接穿透途徑不需要特異細(xì)胞蛋白參與，屬于非能量依賴型，能夠在細(xì)胞處于4 ℃的狀態(tài)下穿透細(xì)胞膜。細(xì)胞膜磷脂雙分子層以及其他組分構(gòu)成的疏水核心是帶電大分子穿越細(xì)胞膜的主要障礙。因此當(dāng)細(xì)胞膜某個(gè)區(qū)域的分子組成和位置發(fā)生改變時(shí)，則可能改變細(xì)胞膜局部的滲透性質(zhì)。例如，在細(xì)胞膜上去除膽固醇能夠促進(jìn)穿膜肽的入胞穿透[40]，補(bǔ)充了膽固醇則對直接穿透產(chǎn)生抑制作用[41]。在直接穿透途徑中，引起細(xì)胞膜變化的原因通常是帶正電的穿膜肽和帶負(fù)電細(xì)胞膜的相互作用，因而陽離子型的細(xì)胞穿膜肽相比其他類型穿膜肽更有可能具備直接穿透細(xì)胞膜的能力。目前關(guān)于直接穿膜機(jī)制也有3種不同的理論模型：1)穿膜肽導(dǎo)致細(xì)胞膜形成孔徑通道；2)穿膜肽導(dǎo)致細(xì)胞膜形成暫時(shí)性的孔徑通道；3)穿膜肽導(dǎo)致細(xì)胞膜形成反式膠團(tuán)[42]。第一種模型形成的孔徑相對較大并且存在時(shí)間相對較長(圖 2A)，TAT以及其類似的穿膜肽能夠與細(xì)胞膜上的肌動(dòng)蛋白骨架以及細(xì)胞膜上的受體相互作用以促進(jìn)不同條件下的不同轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，它能通過與磷脂頭部基團(tuán)的多氫鍵作用使細(xì)胞膜產(chǎn)生馬鞍型的彎曲，進(jìn)而導(dǎo)致孔徑的形成[43-44]。在第二種模型中，穿膜肽直接穿透過程中在細(xì)胞膜表面形成一個(gè)親水性的瞬時(shí)孔徑，伴隨著穿膜肽進(jìn)入胞內(nèi)，外部負(fù)電的磷脂頭部從細(xì)胞膜的外部翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的內(nèi)部，因此在穿膜肽進(jìn)入細(xì)胞后膜孔能夠快速閉合(圖 2B)[45]。在第三種模型中，在穿膜肽入胞的過程中，磷脂雙分子層形成反式膠團(tuán)，將穿膜肽包裹其中，通過再次翻轉(zhuǎn)膠束，將穿膜肽釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在這個(gè)模型中需要正電的穿膜肽和細(xì)胞膜有較強(qiáng)的相互作用，要求細(xì)胞膜帶有足夠多的負(fù)電荷(圖 2C)[46]。直接穿膜機(jī)制通常是因?yàn)榇┠る脑斐杉?xì)胞膜的擾動(dòng)和不穩(wěn)定性，從而使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變。神經(jīng)酰胺是一類神經(jīng)遞質(zhì)，也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞膜凹陷彎曲，有研究表明其能夠促進(jìn)穿膜肽的入胞[41]。另外，對于陽離子型穿膜肽的研究表明，基于穿膜肽的胍頭部基團(tuán)、脂肪酸、質(zhì)膜pH的不同，有著多種多樣的作用機(jī)制[47]。 圖片 圖 2 直接穿透途徑 3 穿膜肽的治療應(yīng)用 由于穿膜肽能夠通過共價(jià)鍵或者物理絡(luò)合方式連接多種生物分子，其應(yīng)用范圍也十分廣泛。其中最有價(jià)值的是作為遞送載體促進(jìn)藥物在疾病治療中的效果，將藥物和其他治療分子導(dǎo)入細(xì)胞的能力使穿膜肽具有巨大的治療潛力。近期，筆者團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究探索了細(xì)胞穿膜肽連接的全長IgG抗體的有效細(xì)胞內(nèi)遞送，在乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)抗體9D11的重鏈C末端融合表達(dá)TAT穿膜肽，在不影響其抗原結(jié)合活性和Fc介導(dǎo)的功能的情況下在復(fù)制和感染模型中都能夠有效進(jìn)入活細(xì)胞，并能夠通過TRIM21途徑對HBx蛋白有很好的清除效果，且在體內(nèi)模型中，9D11-TAT能夠顯著降低轉(zhuǎn)基因小鼠血清DNA水平[7]。2017年劍橋大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)的TRIM-AWAY技術(shù)，能夠基于泛素連接酶和Fc受體TRIM21識別結(jié)合內(nèi)源蛋白的抗體，并將它們靶向蛋白酶體實(shí)現(xiàn)內(nèi)源蛋白的快速清除。9D11-TAT對于胞內(nèi)HBx的清除與TRIM-AWAY技術(shù)有異曲同工之處[48]，并使抗體藥物在體內(nèi)的遞送實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)靶標(biāo)的清除成為可能。大量的臨床前研究也證實(shí)了穿膜肽偶聯(lián)藥物在腫瘤、神經(jīng)性疾病、心臟病等疾病的治療中具有應(yīng)用潛力。還有一類特殊的穿膜肽被稱為抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，對多種細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲甚至癌細(xì)胞都具有殺傷能力。對于多重耐藥的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲感染是很好的藥物替代品[49]。 3.1 穿膜肽作為載體的藥物遞送 自從TAT發(fā)現(xiàn)以來，穿膜肽作為載體攜帶蛋白或其他生物分子入胞的能力在體外實(shí)驗(yàn)中不斷被挖掘。隨后在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了TAT連接的β-半乳糖苷酶經(jīng)過腹腔注射后能夠向小鼠所有組織(包括大腦)完成遞送[50]。穿膜肽作為藥物遞送載體使藥物進(jìn)入細(xì)胞，甚至穿越上皮細(xì)胞和血腦屏障，開始被應(yīng)用在許多疾病的治療中。 3.1.1 穿膜肽作為載體在腫瘤治療中的應(yīng)用 穿膜肽在腫瘤治療中最為人熟知的是攜帶腫瘤靶標(biāo)p53蛋白入胞。p53是一種腫瘤抑制因子，在50%的腫瘤中發(fā)現(xiàn)p53的基因突變。TAT連接的p53蛋白(RI-TAT-p53C)以及R11連接的p53蛋白和血球凝集素HA-2 (d11R-p53C-riHA2)，在腹腔注射淋巴瘤小鼠模型后能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡并且延長了小鼠的壽命[51-52]。TAT連接的P15蛋白也被證實(shí)在多個(gè)腫瘤細(xì)胞模型和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有腫瘤抑制作用[53]。 一些小分子的抗腫瘤化療藥物連接穿膜肽后能夠提高他們的膜穿透性、藥物遞送效率、半衰期以及在腫瘤細(xì)胞中的聚集[54-55]。R8通過二硫鍵連接紫杉醇，能夠改善藥物的水溶性、藥代動(dòng)力學(xué)以及耐藥性。目前已經(jīng)發(fā)展到了第四代，很有可能成為有效的化療藥物[56-57]。甲氨喋呤(Methotrexate)通過連接兩種穿膜肽YTA2和YTA4，與單獨(dú)的藥物對比能夠有效提高腫瘤細(xì)胞的殺傷能力[58]。最新的一項(xiàng)研究報(bào)道了甲氨喋呤連接的一種選擇性細(xì)胞穿膜肽能夠高效并且選擇性地靶向肺癌細(xì)胞[59]。阿霉素(Doxorubicin)能夠與許多穿膜肽連接，常見的有TAT和Penetratin，能夠在低濃度下有效誘導(dǎo)CHO細(xì)胞或一些人的腫瘤細(xì)胞系的凋亡[60]。最近有研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)和發(fā)展了多糖-阿霉素-穿膜肽分子復(fù)合物，利用整合素靶向和細(xì)胞穿膜肽雙重協(xié)同作用于癌癥的治療，該復(fù)合物對骨癌、乳腺癌和腦癌細(xì)胞系(SAOS、MCF7和U87)具有高效殺傷作用，同時(shí)對正常細(xì)胞(如HEK 293)的細(xì)胞毒性相對較小[61]。 多數(shù)穿膜肽介導(dǎo)的入胞轉(zhuǎn)運(yùn)并不具備細(xì)胞特異性，在腫瘤治療中也存在較大的風(fēng)險(xiǎn)。因此穿膜肽在腫瘤治療中的發(fā)展趨勢向腫瘤細(xì)胞或組織特異性發(fā)展�？杉せ罴�(xì)胞穿膜肽(Activatable CPPs，ACPP)是將多聚陽離子穿膜肽和多聚陰離子肽用一個(gè)可切割的位點(diǎn)特異性連接肽連接，形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，正常狀態(tài)下多聚陰離子能夠屏蔽穿膜肽的陽離子性使其失去穿膜功能，在腫瘤組織或腫瘤轉(zhuǎn)移過程中高表達(dá)的疾病相關(guān)蛋白酶，比如金屬蛋白酶2/9 (MMP2/9)能夠切割連接肽從而使穿膜肽偶聯(lián)藥物恢復(fù)穿膜能力進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用[62-63]。2009年Tsien利用上述原理設(shè)計(jì)出了第一種可激活的細(xì)胞穿膜肽，在尾靜脈注射小鼠后其抑制性結(jié)構(gòu)域能夠在腫瘤組織中被金屬蛋白酶切割并激活穿膜肽進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中[64]。除了多種上調(diào)的蛋白酶，腫瘤特殊的微環(huán)境——酸性的pH、較低的膜電位、較低的氧濃度等也為可激活穿膜肽的設(shè)計(jì)提供了許多策略。最近一項(xiàng)關(guān)于ACPP的研究利用了腫瘤微環(huán)境中pH的變化，將寡聚精氨酸穿膜肽與pH高度敏感并具有屏蔽陽離子信號的組氨酸-谷氨酸重復(fù)序列通過多聚甘氨酸連接肽連接((HE)10G5R6)。當(dāng)pH在7.5時(shí)，HE折疊覆蓋在CPP上能夠很好地屏蔽CPP信號，在腫瘤微環(huán)境中pH低于6.5時(shí)，CPP肽段能夠舒展開進(jìn)入激活模式[65]。 3.1.2 細(xì)胞穿膜肽穿越上皮細(xì)胞和血腦屏障 大分子藥物的非注射給藥途徑，或者藥物穿越血腦屏障的主要障礙是它們不能夠有效滲透上皮和內(nèi)皮。而穿膜肽的一個(gè)重要應(yīng)用是能夠作為載體攜帶多肽和蛋白質(zhì)跨越腸道[66]、肺上皮[67]以及穿越血腦屏障[68]。 上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通常通過緊密連接(Tight junction)構(gòu)成一個(gè)緊密的單細(xì)胞層，只允許水和小分子營養(yǎng)物質(zhì)通過。經(jīng)典的化學(xué)滲透增強(qiáng)劑，如表面活性劑、膽鹽等能夠促進(jìn)多肽和蛋白質(zhì)在上皮細(xì)胞中的滲透，但對細(xì)胞完整性和細(xì)胞形態(tài)會(huì)產(chǎn)生一定負(fù)面影響。而穿膜肽作為安全高效的載體能夠彌補(bǔ)這個(gè)缺點(diǎn)。2005年，穿膜肽第一次被報(bào)道能夠穿越上皮細(xì)胞，TAT連接的胰島素能夠顯著增加其穿越Caco-2單層細(xì)胞的能力[69-70]。之后多種穿膜肽被報(bào)道能夠作為載體攜帶胰島素、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)、胃泌素、干擾素-β (INF-β)等[71-72]。其中Penetratin是被研究最多的跨越上皮細(xì)胞的穿膜肽載體，Penetratin序列中的精氨酸和賴氨酸的位置可能對其跨越上皮細(xì)胞的能力有重要作用[73]。并且將其氨基酸序列中所有的L型氨基酸都替換成D型氨基酸能夠提高胰島素的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和半衰期[74]。 血腦屏障在很大程度上阻礙了對神經(jīng)性疾病的治療，穿膜肽也開始被研究應(yīng)用于穿越血腦屏障的載體。研究者利用細(xì)胞模型模擬驗(yàn)證了穿膜肽穿越血腦屏障的能力，一種含有單個(gè)α-螺旋的穿膜肽SUV-RF結(jié)合在包裹吉非替尼的脂質(zhì)體上，希望用于治療轉(zhuǎn)移至腦中的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。利用bEnd.3細(xì)胞模型模擬血腦屏障，在下方插入tranwell生長肺腺癌PC9細(xì)胞，研究表明含有穿膜肽的脂質(zhì)體能顯著降低PC9細(xì)胞活力[75]。細(xì)胞穿膜肽穿越細(xì)胞的能力與穿越血腦屏障的能力并沒有太大的相關(guān)性，Spiegeleer評價(jià)了pVEC、SynB3、Tat 47-57、transportan 10 (TP10)和TP10-2五種細(xì)胞穿膜肽穿越血腦屏障的能力，發(fā)現(xiàn)pVEC、SynB3和Tat 47-57具有較高的腦內(nèi)流入速率，而TP10和TP10-2則相對較低。共注射放射性標(biāo)記的BSA并不能在腦中檢測，因此它們穿越血腦屏障并不是由于增加血腦屏障的滲透性而實(shí)現(xiàn)。pVEC具有最高的腦流入率，其腦流出率卻最低，說明血腦屏障對于穿膜肽的透過是有一定選擇性的[68]。 3.2 穿膜肽的抗菌和抗病毒應(yīng)用 抗菌肽通常具有兩親性和較強(qiáng)的陽離子性、熱穩(wěn)定性、產(chǎn)生較低的抗藥性以及對真核細(xì)胞基本沒有毒性等優(yōu)點(diǎn)[76]�？咕淖饔糜诩�(xì)菌或者真菌的脂質(zhì)膜，通過在膜上形成孔洞或增加細(xì)胞膜的滲透性從而殺死微生物[77]。除了對微生物的直接影響外，AMP也能通過提高免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的積累來控制先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[78]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的或者人工合成的抗菌肽的種類已經(jīng)超過了5 000種[79]�？咕木哂休^強(qiáng)的殺滅致病微生物的能力，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、原生動(dòng)物和真菌等。因此抗菌肽可以用于食品和藥物應(yīng)用。已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的具有抗菌效果的穿膜肽包括TAT、pVEC、Pep-1、Tansportan和Penetratin等[80]。 某些抗菌肽在能夠殺死細(xì)菌、真菌和其他微生物的同時(shí)，還具有抗病毒功能�？共《敬┠る目梢酝ㄟ^阻斷病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制過程或者阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)其抗病毒作用，并且保證宿主細(xì)胞不受傷害。最常見的穿膜肽TAT，能夠與CXCR4相互作用，抑制HIV-1的病毒復(fù)制效率[81]。利用噬菌體展示的方法篩選到的抗病毒穿膜肽G1和G2，能夠結(jié)合細(xì)胞表面的肝素硫酸鹽從而阻止HSV-1病毒與細(xì)胞之間的相互作用和膜融合[82]。 4 總結(jié)與展望 自從30年前首個(gè)穿膜肽TAT被發(fā)現(xiàn)，穿膜肽相關(guān)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究已取得許多積極進(jìn)展。一方面，新的具有更高入胞效率的穿膜肽以及理化性質(zhì)優(yōu)化的穿膜肽不斷被發(fā)展出來，形成穿膜肽家族。另一方面，研究證實(shí)不同類型的穿膜肽能夠在不同條件和細(xì)胞類型中通過多樣化的機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞中，并且能夠攜帶治療性蛋白、抗體或核酸分子入胞發(fā)揮效應(yīng)功能，作為藥物遞送載體，近期的研究中有大量的穿膜肽用于癌癥治療的體內(nèi)研究，凸顯了人們對于開發(fā)穿膜肽作為遞送載體的興趣。另外，穿膜肽還能穿透上皮組織和血腦屏障進(jìn)行治療性分子轉(zhuǎn)運(yùn)，顯示了其在臨床上的巨大應(yīng)用潛能。但是，對于細(xì)胞穿膜肽的研究和應(yīng)用還存在諸多不完善的地方。多種因素影響甚至單個(gè)細(xì)胞穿膜肽入胞使穿膜肽入胞機(jī)制的研究復(fù)雜化，針對需要穿膜的分子、細(xì)胞或者組織屏障可能需要一些量身定做的細(xì)胞穿膜肽。并且在穿膜肽內(nèi)吞機(jī)制中穿膜肽及其攜帶物從囊泡中釋放的效率也很大程度上影響著穿膜肽的應(yīng)用。有研究表明使用一些內(nèi)涵體溶解序列或者促進(jìn)膜融合的分子能一定程度提高穿膜肽及其攜帶分子在囊泡中的釋放效率[83]。但還需要尋找更高效的融合序列和分子或者更高效的其他策略。此外，穿膜肽的治療應(yīng)用需要特別重視的是其安全性問題，包括免疫原性以及質(zhì)膜擾動(dòng)引起的細(xì)胞毒性問題[84]，兩種問題都與細(xì)胞穿膜肽的特定序列相關(guān)，所以并沒有一般性的解決方法。最近已經(jīng)進(jìn)行了一些研究以確定對免疫系統(tǒng)的可能作用以及生物體中隨后的免疫反應(yīng)，但是沒有觀察到一般的免疫應(yīng)答。關(guān)于細(xì)胞毒性，目前大部分細(xì)胞穿膜肽的細(xì)胞毒性較低。但是在新型穿膜肽的開發(fā)研究中，這兩個(gè)安全性問題始終是評估的關(guān)鍵因素。雖然某些穿膜肽被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤特異性，并且可激活的細(xì)胞穿膜肽一定程度上為穿膜肽的特異性靶向提供了方向，但大部分的穿膜肽缺乏選擇性仍是一個(gè)重要的問題，如何尋找對于大多數(shù)穿膜肽都適用的細(xì)胞或組織特異性靶向策略尤為關(guān)鍵，例如融合組織特異性的靶向分子或抗體�？傊�，還需要對穿膜肽入胞機(jī)制有更深入的研究，有助于發(fā)展可實(shí)現(xiàn)特定細(xì)胞靶向?qū)氚踩咝У纳锎蠓肿舆f送系統(tǒng)，并為設(shè)計(jì)和發(fā)展新型高效穿膜肽奠定理論基礎(chǔ)。 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