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IP和CO-IP免疫共沉淀—優(yōu)缺點 已有1人參與
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免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復合物,沉淀經過洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。 免疫共沉淀(Co- Immunoprecipitation, Co-IP)是利用抗原和抗體的特異性結合以及細菌的Protein A或G特異性地結合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。其基本原理是,在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體,孵育后再加入與抗體特異結合的結合于Agarose珠上的Protein A或G,若細胞中有與興趣蛋白結合的目的蛋白,就可以形成這樣一種復合物:“興趣蛋白—抗性蛋白抗體—Protein A或G—Agarose珠”,經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,復合物又被分開。然后經免疫印跡或質譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內與興趣蛋白天然結合的,符合體內實際情況,得到的結果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。 優(yōu)點 (1)相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài); (2)蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的,可以避免人為的影響; (3)可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。 缺點 (1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用; (2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作用; (3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇最后檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。 (4)靈敏度沒有親和色譜高。 服務要求 提供新鮮樣本材料和IP及WB的一抗(或由我公司代購) 注:免疫共沉淀(co-IP)通常必須使用未經凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品,但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。 服務基本流程 1. 裂解樣品,準備蛋白樣品; 2. 準備抗體-Protein A/G beads; 3. 樣品,抗體-Protein A/G bends共孵育; 4. 洗脫; 5. WB檢測。 服務報告內容 WB結果和實驗報告。 |
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2樓2022-11-09 13:50:58
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