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動物造模 | 肺纖維化動物模型
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肺纖維化（ pulmonary fibrosis，PF）是一種間質(zhì)性肺疾病，以巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞在肺間質(zhì)浸潤、纖維母細胞增生及纖維結(jié)締組織沉積于肺間質(zhì)致使出現(xiàn)彌散性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，并最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征，是一系列慢性肺部疾病的最終結(jié)局。因為肺纖維化的體外研究受到條件的限制，目前基本沒有合適的研究方法，因此建立與人肺纖維化病理過程相似的動物模型尤為重要。 動物的選擇 目前，肺纖維化動物模型有采用體型較小鼠類（如小鼠、大鼠、倉鼠等）和兔。其中 C57BL/6 小鼠、BALA/C 小鼠、KM 小鼠和 ICR 小鼠，Wistar 大鼠和SD 大鼠是用于肺纖維化模型最常用的種類，也有選用體型較大的犬、豬、羊和靈長類動物等，模型選用的動物種類因研究目的和造模方法不同而異。 鼠類是較多選用的肺纖維化動物模型，體型小、體重輕、價格便宜，有氣管灌注、霧化吸入、經(jīng)鼻給藥、腹腔注射、靜脈注射等多種給藥方式，是常用的造模動物，但因其體型太小不適用于放射影像學(xué)的研究，需要通過解剖摘取肺部進行組織病理學(xué)檢查的方法判斷造模是否成功。 豬、猴等大型動物體型大，心臟及肺部組織結(jié)構(gòu)與人相似，并且可通過影像學(xué)方法在無創(chuàng)條件下動態(tài)觀察動物造模情況，但價格昂貴，操作較復(fù)雜。 造模方法 目前已建立多種誘發(fā)動物肺纖維化模型的方法，包括基因相關(guān)模型與非基因相關(guān)模型�；蛳嚓P(guān)模型是指通過基因工程使動物成為肺纖維化模型，而非基因相關(guān)模型是指在相同或相似的遺傳背景下，通過環(huán)境因素、藥物毒物或其他因素誘導(dǎo)得到的肺纖維化模型。 一、基因相關(guān)方法致肺纖維化模型 轉(zhuǎn)基因方法包括細胞因子過表達法、靶向Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷法。 1 SD大鼠細胞因子過表達法致肺纖維化模型步驟 前期準(zhǔn)備：AdTGF-β1223/225 及腺病毒空載體 -70℃保存，臨用前經(jīng)病毒稀釋液稀釋成 1×109pfu（病毒稀釋液由三種溶液構(gòu)成，其配制方法：A 液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.15 g，KH2PO4 0.2 g，加雙蒸水定容至100 mL，高壓消毒；B 液：CaCl2·2H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒；C 液：MgCl2·6H2O 0.1 g 定容至 10 mL，高壓消毒。用前取 98 mL A 液、1 mL B 液、1 mL C 液混合備用。 操作步驟：選用 SD 大鼠，體質(zhì)量（250±15） g，腹腔注射速眠新麻醉（0.4 mL·kg-1），無菌操作，剪開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，充分暴露氣管，經(jīng)喉頭下一次性注入 0.4 mL AdTGF-β1223/225 腺病毒液，手術(shù) 6 h 后觀察并記錄動物生理反應(yīng)。 模型驗證：分別與造模后 d 7、d 14、d 21，麻醉后開胸，左心室插管，先灌流溫?zé)幔ㄊ覝兀┥睇}水，剪開右心耳放血，待流出液變澄清后再緩慢灌流 4% 多聚甲醛水溶液（200 mL·30 min-1）。小心摘取整個肺和心，經(jīng)氣管恒壓（2 452 Pa）灌注 4% 多聚甲醛固定液 10 min，使肺泡恢復(fù)擴張狀態(tài)。沿縱軸切取肺組織浸入 4% 多聚甲醛固定液中固定 24 h，做常規(guī)石蠟包埋、石蠟切片、HE 染色和 Mallory 染色，光鏡觀察、攝片。 2 靶向Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷法 靶向Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷法是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將白喉毒素受體與Ⅱ型肺泡上皮細胞啟動子通過載體融合，白喉毒素不斷刺激轉(zhuǎn)基因小鼠，致肺纖維化。通過敲除特定基因或?qū)胪蛔兓蚴够蛲蛔円材芙⒎卫w維化動物模型，與肺纖維化有關(guān)的基因包括：肺表面活性蛋白C、肺表面活性蛋白A2（SFTPA2）、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和端粒酶 RNA復(fù)合酶（TERC）。 轉(zhuǎn)基因方法的優(yōu)勢：基因技術(shù)造模方法比較于傳統(tǒng)造模方法，靶點明確，對篩選抗纖維化藥物意義重大。除此之外，通過誘導(dǎo)時間特定啟動子，可模擬肺纖維化晚期出現(xiàn)的臨床癥狀。 轉(zhuǎn)基因方法的劣勢：介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因用的病毒載體本身具有潛在危害性，且人類肺纖維化是多基因多種因子作用的結(jié)果，因此單一的基因模型與多基因相關(guān)的肺纖維化模型存在一定差異。 二、非基因相關(guān)方法致肺纖維化模型 常用的非轉(zhuǎn)基因方法主要為物理化學(xué)方法，包括博萊霉素誘導(dǎo)法、平陽霉素誘導(dǎo)法、百草枯誘導(dǎo)法、石棉誘導(dǎo)法、輻射誘導(dǎo)法�；瘜W(xué)誘導(dǎo)法及石棉誘導(dǎo)法通常通過皮下、靜脈注射，或者霧化吸入等途徑給藥，輻射誘導(dǎo)法則直接進行射線照射。 1 博萊霉素致肺纖維化模型 目前博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化有氣管內(nèi)一次給藥或多次給藥，也有腹腔給藥、鼻內(nèi)給藥、靜脈給藥、霧化吸入多種方式。氣管內(nèi)一次給藥是最常用的造模方式。 1.1 大鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素致肺纖維化模型 步驟：選用健康雄性8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，用 10% 水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰臥固定于實驗臺，開口器固定口腔，拉出舌，用壓舌板壓舌腹，在額鏡直視下，趁動物吸氣瞬間迅速行氣管插管（Ф 2 mm，4~5 cm），緩慢注入 5 mg·kg-1BLM 0.2~0.3 mL，立即旋轉(zhuǎn)動物，使藥液在肺內(nèi)均勻分布，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標(biāo)本。 特點：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時間短等優(yōu)點，但動物死亡率較高，操作復(fù)雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周圍為顯著的特點。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉素誘導(dǎo)的動物肺纖維化是國內(nèi)外最常用、最受認可的肺纖維化模型。 1.2 倉鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素致肺纖維化模型 步驟：取10 周齡雄性敘利亞倉鼠，用生理鹽水配制 1 U 博萊霉素溶液，單次氣管內(nèi)注射 0.1 mL，注射藥物 3 周后，取肺組織進行細胞原代培養(yǎng)，3H-TdR 整合實驗評估成纖維細胞增殖效果。 特點：氣管內(nèi)一次給藥法有給藥次數(shù)少、劑量小、制模時間短等優(yōu)點，但動物死亡率較高，操作復(fù)雜，急性肺損傷程度重、膠原代謝紊亂的程度輕，病灶分布不均，以支氣管周圍為顯著的特點。目前一次性氣管內(nèi)灌注博萊霉素誘導(dǎo)的動物肺纖維化是國內(nèi)外最常用、最受認可的肺纖維化模型。 1.3 大鼠腹腔內(nèi)注射博萊霉素致肺纖維化模型 步驟：選用健康雄性 8~10 周齡 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，每日腹腔注射 15 mg·kg-1 BLM 10 天，自由飲水、攝食，d 1、d 14、d 28 采集標(biāo)本。 特點：腹腔內(nèi)給藥法具有給藥次數(shù)多、劑量大、制模時間長等缺點，但動物死亡率相對較低，且操作簡便，急性肺損傷程度較輕、膠原代謝紊亂的程度較重，病灶分布均勻，以胸膜下為顯著的特點。 1.4 小鼠鼻腔滴入博萊霉素致肺纖維化模型 步驟：選用 SPF 級雌性 ICR 小鼠，6~8 周齡，體質(zhì)量16~18 g，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，鼻腔滴注博萊霉素造模。用乙醚麻醉小鼠，后用微量移液器吸取 50 μL 博萊霉素溶液（15 mg·kg-1 進行干預(yù)），經(jīng)鼻腔緩慢滴入小鼠氣管內(nèi)，放入鼠籠內(nèi)安置，觀察其造模后一般情況。 2 平陽霉素致肺纖維化模型 平陽霉素是一種抗腫瘤抗生素，具有肺毒性，文獻中通常采用大小鼠氣管注射或霧化吸入的方式建立肺纖維化模型。 2.1 大鼠氣管穿刺注入平陽霉素致肺纖維化模型 步驟：選用SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，將平陽霉素用生理鹽水配成 5 g·L-1 的溶液。10% 水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）麻醉大鼠，頸部皮膚消毒，剪去頸部鼠毛，行頸正中切口，分離暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺，注入平陽霉素 5 mg·kg-1，立即將動物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，縫合皮膚，自由飲水、攝食，保持自然光照，d 28 采集標(biāo)本。 2.2 大鼠霧化吸入平陽霉素致肺纖維化模型 步驟：將 Wistar 大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，放入長、寬、高各 40 cm 玻璃缸內(nèi)，玻璃缸與超聲霧化器相連通，通過霧化管向缸內(nèi)噴入霧化液，缸上蓋薄塑料板，板上留一個小的通氣孔。將平陽霉素和生理鹽水配成2 mg·mL-1的溶液，霧化吸入10 min。自由飲水?dāng)z食，d 28 采集標(biāo)本。 3 百草枯致肺纖維化模型 3.1 小鼠口服百草枯致肺纖維化模型 步驟：有研究表明，昆明小鼠口服百草枯的 LD50 為 137.3 mg·kg-1，給予百草枯后小鼠全部存活的最高劑量為 100 mg·kg-1，故確定百草枯的給藥劑量為 100 mg·kg-1。KM 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，禁食 16 h 后，一次性灌胃 20% 百草枯水溶液后正常進食、飲水。 4 石棉微粒致肺纖維化模型 石棉纖維經(jīng)氣管內(nèi)單次灌注給藥（<5 μm 直徑的石棉顆粒）是一種相對快速的纖維化造模方式，操作簡便、快速、成功率高。 4.1 大鼠肺注入石棉微粒致肺纖維化模型 步驟：取石棉成品，經(jīng)研磨，用 200 目鋼篩濾過、水選，制備石棉微粒。95% 以上石棉粉塵微粒直徑 <5 μm，用生理鹽水配成 20 mg·mL-1 的濃度，經(jīng)高壓滅菌備用。選用Wistar大鼠，雌性，體質(zhì)量（180~200）g，將 Wistar 大鼠置密封罐中，滴入乙醚，待充分麻醉后，將 20 mg·mL-1 的石棉生理鹽水 1 mL，人耳鏡插入大鼠氣管開口，確認聲帶活動后，用腰分針（折去頭），直接注入肺內(nèi)，輕揉雙肺片刻。在 2、4、6、8 周分別處死后，立即取大鼠肺、心、肝、腎等組織浸泡在福爾馬林內(nèi)。 5 輻射誘導(dǎo)法致肺纖維化模型 5.1 大鼠輻射誘導(dǎo)法致肺纖維化模型 步驟：選用雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量（220±20）g，無異常者進行 60 Coγ射線全胸單次照射，照射野為4.5 cm×4.0 cm，照距為3 m，劑量率為2.7 Gy·min-1，劑量為30 Gy。照射時，將大鼠上至兩腋窩、下至胸骨劍狀突的位置對準(zhǔn)此照射野，用 10 cm 厚鉛磚屏散裝置屏蔽大鼠其余部分，照射后隨機分籠喂養(yǎng)。分別于照后 3、7、14、21、28、42、56、70、90、180、270、365d 共 12 個時間點進行取材觀察。取各時間點肺臟經(jīng)病理宏觀檢查后，固定于 12%緩沖中性福爾馬林中，用常規(guī)法制成石蠟切片，經(jīng) HE染色后進行光鏡觀察。 總結(jié) 動物模型是研究肺纖維化的重要工具，目前還沒有一種肺纖維化模型能完全模擬臨床肺纖維化病理特點，但利用現(xiàn)有的肺纖維化模型，我們能通過不同類型的肺纖維化模型了解肺纖維化不同特點，篩選更敏感的模型。隨著技術(shù)進步和研究的改進，我們也會建立更符合臨床肺纖維化病理特征的動物模型。 文獻： [1]張丹參,馬佳呈.誘發(fā)肺纖維化動物模型方法及評價[J].神經(jīng)藥理學(xué)報,2019,9(06):15-20. [2]郭琦琦,李毅,翁桓澤,王倩,賈敏.生物及非生物因素誘導(dǎo)肺纖維化動物模型研究的特點[J].中國組織工程研究,2022,26(14):2273-2278. |
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