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里來(lái)醫(yī)學(xué)銅蟲(chóng) (小有名氣)
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條帶依舊問(wèn)題百出？IP/CoIP細(xì)節(jié)TIPS，為您整理！ 已有1人參與
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細(xì)胞功能，最后的執(zhí)行者大多數(shù)都是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可謂是細(xì)胞的調(diào)控者，控制著細(xì)胞中的所有工作，但是想要細(xì)胞高效運(yùn)作，往往需要多個(gè)蛋白參與，蛋白質(zhì)之間的相互作用，貫穿整個(gè)生命周期，參與完整的生命過(guò)程。 想要研究清楚細(xì)胞的運(yùn)作機(jī)制，蛋白之間的互作就是最基礎(chǔ)的研究項(xiàng)目，而 IP/CoIP 則是研究這基礎(chǔ)上的常用方法，關(guān)于 CoIP 的實(shí)驗(yàn)原理和方法前文已科普。 然而IP/CoIP 雖然常用，但并不簡(jiǎn)單，可以稱得上是門(mén)技術(shù)活，跟著步驟一步步做，都可能會(huì)做不出好看的條帶圖，那其中有哪些需要注意的地方呢 簡(jiǎn)述實(shí)驗(yàn)步驟 Co-IP實(shí)驗(yàn)基本步驟 ·溫和條件下破碎細(xì)胞 ·加入目標(biāo)蛋白抗體，孵育結(jié)合 ·加入親和介質(zhì)進(jìn)行洗脫 ·對(duì)洗脫蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析 實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的細(xì)節(jié)TIPS 稍不注意，目的蛋白丟失 1. 非特異的蛋白結(jié)合：在免疫沉淀前用 ProteinA/G 珠子預(yù)洗，免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度（高鹽或者去垢劑）； 2. 裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低：改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液； 3. 實(shí)驗(yàn)儀器或者液體被污染：使用潔凈的儀器或者液體； 4. 轉(zhuǎn)移膜上存在非特異性吸附：戴手套、用鑷子，不觸碰膜轉(zhuǎn)移面。 選擇兩個(gè)不同種源的抗體 在實(shí)驗(yàn)中，IP的抗體用量較大，會(huì)導(dǎo)致抗體重鏈55kd的信號(hào)會(huì)很強(qiáng)。如果用單一種源的抗體作為二抗進(jìn)行顯色，那么抗體重鏈55kd處的IP抗體的重鏈會(huì)干擾我們對(duì)目的蛋白的分辨如果選擇兩種種源的抗體，則不會(huì)有這個(gè)問(wèn)題。 磁珠or瓊脂糖？ 任選，種類不重要，關(guān)鍵是品質(zhì)！ 磁珠或者瓊脂糖的作用在于ProteinA/G可以特異性結(jié)合免疫球蛋白的FC片段，從而結(jié)合抗體，而抗體又可以和目的蛋白結(jié)合，優(yōu)質(zhì)的磁珠或者瓊脂糖珠子對(duì)我們實(shí)驗(yàn)的成功幫助很大。 CoIP 為何經(jīng)常遇到假陽(yáng)性？ 假陽(yáng)性主要和抗體的濃度還有特異性有關(guān)，所以當(dāng)抗體濃度高了，就降低濃度；抗體特異性差，就更換抗體。 如何去除重鏈和輕鏈的影響 陰性對(duì)照記得加，可以采用的方法很多，比如用兔的lgG做對(duì)照，或者用抗 Fab和Fc的抗體特異性封閉輕鏈和重鏈。 蛋白互作信號(hào)弱，低到總是測(cè)不到 1. 裂解液過(guò)于強(qiáng)烈：采用溫和的裂解條件，避免破壞細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白間相互作用，裂解、洗滌時(shí)需使用非變性裂解液，如 NP-40 和 Triton X-100； 2. 受蛋白亞細(xì)胞定位的影響：應(yīng)該重新選擇其他裂解液來(lái)釋放出蛋白； 3. 蛋白間相互作用弱：增加目的蛋白的量，以捕獲更多的相互作用蛋白，從而得到更容易觀察的結(jié)果。具體辦法有選擇親和力更強(qiáng)的抗體捕獲更多目的蛋白�；蛘哌^(guò)表達(dá)提高目的蛋白的含量。 |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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你好，請(qǐng)問(wèn)一變性裂解液提取蛋白可以檢測(cè)到信號(hào)，但是用非變性裂解液（NP40， RIPA弱，WB&IP裂解液我都試過(guò)）提取蛋白檢測(cè)不到信號(hào)是為什么呢？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
2樓2023-09-30 23:50:36
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