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艾柏森_LB新蟲 (初入文壇)
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熒光原位雜交技術(shù)操作的注意事項(xiàng)及常見問題
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什么是熒光原位雜交技術(shù)？ 熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測(cè)該特異微生物種群的存在與豐度。 熒光原位雜交技術(shù)的背景及優(yōu)勢(shì) 熒光原位雜交技術(shù)問世于70年代后期，其曾多用于染色體異常的研究，近年來隨著FISH所應(yīng)用的探針鐘類的不斷增多，特別是全Cosmid探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn)，使FISH技術(shù)不僅在細(xì)胞遺傳學(xué)方面，而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究，如基因診斷基因定位等 。 原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。 此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤差等。與之比FISH則具有： ①操作操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年； ②方法敏感，能迅速得到結(jié)果； ③在同一標(biāo)本上，可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針； ④不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究等特點(diǎn)。 熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是：如果被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。 將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。 雖然FISH具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是該技術(shù)操作相對(duì)復(fù)雜，以下總結(jié)了該項(xiàng)操作的注意事項(xiàng)及常見問題。 1、開展FISH所需要的實(shí)驗(yàn)條件和人員培訓(xùn)建立 FISH技術(shù)平臺(tái)，除需要一間可以進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)操作和顯微觀察暗室外，還需要原位雜交儀、熒光顯微鏡、顯微鏡濾光片、水浴箱、漩渦混合器、普通離心機(jī)、移液器、FISH探針試劑盒、無水乙醇、二甲苯、去離子水、橡膠水泥、透明指甲油等設(shè)備和試劑。 由于FISH檢測(cè)具有敏感性和客觀性，任何一個(gè)步驟的微小失誤均有可能對(duì)結(jié)果的判讀產(chǎn)生偏差，進(jìn)而對(duì)臨床的合理用藥產(chǎn)生影響，因此就對(duì)操作的技術(shù)人員在熟練和規(guī)范程度做出更高的要求。 建議每一個(gè)開展分子病理檢測(cè)的病理科設(shè)置專門的分子病理室并由專人操作，并且要求專門的技術(shù)人員有相關(guān)的分子生物學(xué)理論知識(shí)，并經(jīng)過專門培訓(xùn)，有一定的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)。 2、固定液的選擇及固定時(shí)間 石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林固定6～48h，其它固定液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。 組織離體后應(yīng)盡快固定，建議在標(biāo)本離體后30min內(nèi)固定。如樣本固定不及時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)減弱。 固定液的體積是組織體積的4～20倍，否則固定不充分，容易出現(xiàn)無信號(hào)或者信號(hào)很弱的現(xiàn)象。 而且，為了保證信號(hào)的準(zhǔn)確性，蠟塊最好在2年內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，已經(jīng)切好的切片在6周內(nèi)檢測(cè)最佳。 3、組織切片和載玻片的選擇 組織切片4～5μm 厚，過厚或過薄的切片均會(huì)對(duì)信號(hào)的強(qiáng)弱產(chǎn)生影響，而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會(huì)在預(yù)處理時(shí)掉片。 載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實(shí)驗(yàn)室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。 4、實(shí)驗(yàn)過程中切片的預(yù)處理 切片預(yù)處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。當(dāng)組織處理不規(guī)范、切片過厚或烤片不足時(shí)，在煮沸過程中容易掉片，建議烤片溫度在56℃過夜。 煮沸過程中要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)溫度和時(shí)間。酶消化是 FISH 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，如果對(duì)組織不熟悉，可以先消化推薦的反應(yīng)時(shí)間，然后復(fù)染 DAPI在熒光顯微鏡下觀察，在DAPI通道下，以細(xì)胞既無空洞(消化過度)，亦無明顯的云霧狀(消化不足)為最佳，同時(shí)可切換觀察紅綠通道，以紅綠通道無明顯的背景為佳，如果背景較高，可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。 另外，對(duì)于陳舊的石蠟組織切片，要適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，否則會(huì)出現(xiàn)大量的自發(fā)熒光。若消化不足所致 FISH 信號(hào)減弱或丟失，消化良好時(shí)FISH信號(hào)較好。 5、變性和雜交 變性和雜交是本實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的步驟，變性的時(shí)間和溫度是雜交成功是否的關(guān)鍵，為保證變性期間溫度的穩(wěn)定，建議采用專業(yè)的原位雜交儀進(jìn)行變性和雜交步驟，不僅能夠減少實(shí)驗(yàn)的繁瑣性，而且更有利于實(shí)驗(yàn)條件的控制，比如時(shí)間、溫度和避光條件等。為避免雜交液在變性和雜交過程中的損失和防止干片，一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進(jìn)行密封。 6、雜交后洗滌溫度、時(shí)間和封片保存 雜交后的洗滌對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響非常重要，首先應(yīng)保證正確配置雜交洗滌液，洗滌液溫度偏高或時(shí)間過長(zhǎng)，可導(dǎo)致信號(hào)減弱，洗滌液溫度偏低或者時(shí)間過短，會(huì)產(chǎn)生雜信號(hào)過多、紅綠信號(hào)對(duì)比性差或者特異性低等情況。 在復(fù)染完 DAPI 以后，加蓋蓋玻片，用指甲油固定住蓋玻片四角，這樣可以防止在油鏡下觀察時(shí)蓋玻片脫落。由于熒光信號(hào)容易淬滅，所以在染色后應(yīng)立即觀察，如果當(dāng)時(shí)不能觀察，可將切片放入切片盒中，保存于－20℃冰箱里2周以內(nèi)。 7、設(shè)置對(duì)照 每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照: 實(shí)驗(yàn)室在每一輪檢測(cè)中均應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照材料( 陽性、陰性和可疑)。如果對(duì)照材料沒有顯示預(yù)期的結(jié)果，則不能對(duì)結(jié)果做出判定。 8、結(jié)果判讀 應(yīng)選擇細(xì)胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無重疊、信號(hào)清晰的細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)至少20個(gè)浸潤(rùn)性癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)。判讀標(biāo)準(zhǔn)參考《乳腺癌 HER-2檢測(cè)指南(2014版)》，對(duì)于FISH結(jié)果不確定的病例，需要再計(jì)算20個(gè)細(xì)胞核中的信號(hào)或由另外一位病理診斷醫(yī)師重新計(jì)數(shù)。 如仍為臨界值，則應(yīng)行免疫組化檢測(cè)(若FISH檢測(cè)前未行)，也可以選取不同的組織塊重新檢測(cè)。HER-2 FISH 檢測(cè)在我國(guó)發(fā)達(dá)地區(qū)的三級(jí)醫(yī)院已普遍開展，針對(duì)HER-2過表達(dá)的曲妥珠單抗在我國(guó)已上市多年，檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果的正確判讀，對(duì)于正確選擇合適的患者，指導(dǎo)臨床治療顯得尤為重要。 國(guó)家在大力推廣FISH檢測(cè)方法的同時(shí)，還需制定統(tǒng)一的HER-2基因檢測(cè)的報(bào)告指南及早日進(jìn)行質(zhì)量化認(rèn)證，以保證各醫(yī)院之間的結(jié)果相對(duì)一致，更好的服務(wù)于患者。 |
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