 |
 |
 |
| 24小時熱門版塊排行榜 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1619 | 回復(fù): 1 | |||
里來醫(yī)學(xué)銅蟲 (小有名氣)
|
[交流]
蛋白標(biāo)簽意義及常用標(biāo)簽的介紹 已有1人參與
|
|
蛋白質(zhì)作為生命活動的主要執(zhí)行者，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生都與其結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān)。因此，想要對某一特定的蛋白進(jìn)行分析與研究則成為一項頗為棘手的問題。此時，蛋白標(biāo)簽（Protein tag）開始著手解決這些問題。 蛋白質(zhì)的檢測方法最為應(yīng)用廣泛的是免疫分析，常用的方法有：WB（Western Blot）、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）、IP（Immunoprecipitation）等。免疫分析需要將目標(biāo)蛋白作為抗原，注射動物，然后從免疫血清中分離抗體，根據(jù)抗原－抗體間的免疫反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測。這種方法最大的缺陷就是每更換一個目標(biāo)蛋白就要制備一個對應(yīng)的抗體，操作繁瑣，成本昂貴。融合標(biāo)簽的使用，使蛋白質(zhì)免疫分析走向通用化和便利化。我們將特定的標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白融合后，兩者是共同表達(dá)的，通過檢測融合標(biāo)簽，可以得到目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。 蛋白標(biāo)簽（Protein tag）技術(shù)是指利用基因克隆手段，將具有特定功能的多肽，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，甚至完整蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白融合在一起，以實現(xiàn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)純化，檢測和示蹤等應(yīng)用的技術(shù)。蛋白標(biāo)簽融合已經(jīng)成為蛋白質(zhì)研究中最常用的技術(shù)之一。經(jīng)過長期的研究，目前已經(jīng)開發(fā)出一些比較成熟的檢測標(biāo)簽，下面就挑幾個來介紹一下： 幾種常規(guī)蛋白純化標(biāo)簽比較 常用的蛋白標(biāo)簽有哪些？ HIS標(biāo)簽 His標(biāo)簽是當(dāng)前最為熱門的標(biāo)簽蛋白之一。His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當(dāng)某一個標(biāo)簽的使用，一是能構(gòu)成表位利于純化和檢測；二是構(gòu)成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征（結(jié)合配體）利于純化。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析（IMAC），對重組蛋白進(jìn)行分離純化。 Flag-tag Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。 AviTag 是一個15個氨基酸的短肽，具有一個單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C端。融合表達(dá)后，可被生物素連接酶生物素化，為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。 SNAP-Tag SNAP-Tag是從人的O6－甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移（O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase）獲得。SNAP所帶的活性巰基位點(diǎn)接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側(cè)鏈苯甲基基團(tuán)，釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結(jié)合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團(tuán)所帶的標(biāo)記物。 檢測：生物素或各種顏色熒光的底物（如熒光素、若丹明）可滲透進(jìn)入細(xì)胞，方便快捷地進(jìn)行活細(xì)胞內(nèi)SNAP-Tag融合蛋白的標(biāo)記與檢測。它們也可特異性地標(biāo)記大腸桿菌，酵母和哺乳動物等細(xì)胞抽提液或已經(jīng)純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶） GST標(biāo)簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD。GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。GST標(biāo)簽可用酶學(xué)分析或免疫分析很方便的檢測。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。 純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進(jìn)行純化。 如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。 GFP GFP（綠色螢光蛋白）是由下村修等人在水母中發(fā)現(xiàn)的。它在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光。GFP標(biāo)簽可位于蛋白質(zhì)的C端或N端，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、酵母和哺乳動物細(xì)胞等，相應(yīng)的GFP標(biāo)簽抗體也被廣泛應(yīng)用。GFP在檢測蛋白表達(dá)、蛋白和細(xì)胞熒光示蹤、研究蛋白質(zhì)之間相互作用和構(gòu)象變化中，起到了重要的作用。 常規(guī)化的c-Myc C-Myc標(biāo)簽蛋白，是一個含11個氨基酸的小標(biāo)簽，它作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)框架中可識別其相應(yīng)抗體。C-Myc tag已成功應(yīng)用在Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計量術(shù)中，可用于檢測重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。 熒光素酶（luciferase） 來源于生物體內(nèi)的熒光素，常見的有螢火蟲熒光素酶、海腎熒光素酶和Guassia熒光素酶。這些熒光素酶作為“報告蛋白”被用于分子生物學(xué)研究中，這種技術(shù)被稱為報告基因檢測法或螢光素酶檢測法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白標(biāo)簽不同，使用熒光素酶構(gòu)建的報告基因可用作目的基因的定量分析。因此常用于研究啟動子、miRNA 3\\\\\\\'UTR克隆的功能與調(diào)控，因為它們對目的基因的調(diào)控可以是漸變的，而不是簡單的開和關(guān)兩種狀態(tài)。 該如何選擇表達(dá)克隆的標(biāo)簽 1、首先，需要確定融合標(biāo)簽的目的 蛋白純化 ：標(biāo)簽的普遍用途是蛋白純化。小分子6XHis Tag常被用于細(xì)胞內(nèi)源蛋白的純化。6XHis Tag也廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的蛋白純化�？墒遣溉閯游锛�(xì)胞中因非分泌蛋白自身存在高組氨酸背景，因此極少使用6XHis Tag。 Western Blot檢測：若需要做Western Blot實驗來檢測細(xì)胞裂解物中蛋白的表達(dá)，你可以選擇有匹配的抗體的小分子標(biāo)簽。FLAG® Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業(yè)化的抗體等優(yōu)勢，成為Western Blot實驗中常用的Tag。 免疫沉淀反應(yīng)：FLAG® Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業(yè)用抗體等優(yōu)勢成為免疫沉淀反應(yīng)中最常用的Tag. 其他常用的標(biāo)簽有：HA和cMyc. 免疫共沉淀。首先，裂解您的樣本，以釋放蛋白。向試管中添加裂解液的同時，加入靶向融合標(biāo)簽的抗體，抗體會識別融合標(biāo)簽。然后抗體與蛋白 A 或 G 偶聯(lián)微珠結(jié)合，后者拉出您的目標(biāo)蛋白，以及與之復(fù)合的其他蛋白。 活細(xì)胞成像：熒光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）是活細(xì)胞成像常用的標(biāo)記蛋白。其中最常用的是綠色熒光蛋白（GFP）和它的衍生物（CFP, YFP, etc.），以及一些紅色變體，如dTomato和mCherry. 2、考慮融合標(biāo)簽的影響 任何一類標(biāo)簽處于氨基酸序列的任一位置，都具有影響目的蛋白表達(dá)或功能的可能性。最主要原因是標(biāo)簽可能會干擾蛋白的正確折疊，致使目的蛋白失活或形成包涵體。其次，標(biāo)簽可能會中斷亞細(xì)胞定位信號，這種情況下，蛋白能夠正確翻譯和折疊，但在細(xì)胞內(nèi)所處的位置是錯誤的。因此，您需要知道添加的標(biāo)簽對目的蛋白的表達(dá)是否有影響。 3、考慮是在N-端還是C-端標(biāo)記 N-端或C-端標(biāo)記的選擇還需要根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、定位等特性。然而，倘若你沒有確切的蛋白結(jié)構(gòu)，或蛋白功能域圖譜，建議分別構(gòu)建N-端標(biāo)記和C-端標(biāo)記的表達(dá)克隆，以檢測哪個更有效。 重組蛋白表達(dá)技術(shù)現(xiàn)已在生物學(xué)各個具體領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其是蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)和體內(nèi)功能研究都需要應(yīng)用重組蛋白表達(dá)載體。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
26申博自薦
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
進(jìn)入個人成果庫好難，一下午都沒進(jìn)去
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
接受26屆調(diào)劑生
已經(jīng)有12人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
求調(diào)劑 一志愿蘇州大學(xué)，0856化工323分 | 本科應(yīng)化 | 有專利/競賽/科研助手經(jīng)歷 |
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
308求調(diào)劑
已經(jīng)有9人回復(fù)
-
303求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復(fù)
-
085600材料與化工 292分 求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
一志愿中石油，化學(xué)工程，301求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
 |
2樓2022-11-27 09:54:31
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 里來醫(yī)學(xué) 的主題更新
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +5 | wxz2 2026-03-03 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 初試297求調(diào)劑 +3 | 一個蘿蘿 2026-02-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +4 | 大爆炸難民 2026-03-06 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿清華深研院材料專碩294分，專業(yè)課111分，本科中南大學(xué)材料，有六級，有工作經(jīng)驗 +3 | H14528 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 化學(xué) 0703求調(diào)劑 總分293 一志愿211 +9 | 土土小蟲 2026-03-03 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +3 | 是樂渝哇 2026-03-04 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 264求調(diào)劑 +8 | 26調(diào)劑 2026-03-03 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 一志愿314求調(diào)劑 +7 | 202111120625 2026-03-03 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085600求調(diào)劑 +4 | LRZZZZZZ 2026-03-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +4 | 杰尼龜aaa 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑一志愿中海洋 +3 | lour. 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)306調(diào)劑 +4 | 26要上岸 2026-03-03 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料工程求調(diào)劑 +3 | 1431251 2026-03-03 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 課題組接收材料類調(diào)劑研究生 +6 | gaoxiaoniuma 2026-02-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 化工京區(qū)271求調(diào)劑 +7 | 11ing 2026-03-02 | 7/350 |
|
|
|
[考博] 博士自薦 +4 | kkluvs 2026-02-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 1 +5 | 2026計算機(jī)_誠心 2026-03-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 化工專碩342，一志愿大連理工大學(xué)，求調(diào)劑 +6 | kyf化工 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +6 | 愛擦汗的可樂冰 2026-02-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 295復(fù)試調(diào)劑 +3 | 簡木ChuFront 2026-03-01 | 3/150 |
|