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小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞元代分離的兩種方法
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貼壁篩選法 ✦ 貼壁篩選法是利用細(xì)胞貼壁時(shí)間及貼壁牢固性的不同，逐步將非貼壁細(xì)胞和其它雜質(zhì)細(xì)胞去除的一種簡(jiǎn)單易行的方法，常用于干細(xì)胞的培養(yǎng)中，因此用于分離BMSCs最為廣泛。 利用BMSCs貼壁生長(zhǎng)特性，更換培養(yǎng)液逐步去除漂浮生長(zhǎng)的造血系統(tǒng)細(xì)胞即可獲得較純化的BMSCs；而且骨髓中的造血干細(xì)胞能分泌生長(zhǎng)因子和促貼壁物質(zhì),可促進(jìn)BMSCs貼壁生長(zhǎng)，貼壁篩選法也常被稱為直接培養(yǎng)法或者全骨髓法。 操作步驟 01 以頸椎脫臼法處死SPF級(jí)3-4周齡C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。 02 隨后在鼠的腿的位置剪開外皮和內(nèi)皮，無菌狀態(tài)下取出雙側(cè)股骨和脛骨，浸泡于無菌含雙抗PBS溶液中。剔除股骨和脛骨周圍的肌肉、結(jié)締組織，用含雙抗的PBS溶液清洗三遍。 03 用眼科剪剪去股骨和脛骨的兩端，暴露骨髓腔。 04 用注射器以完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨頭發(fā)白。 05 收集骨髓液，離心，后加入適當(dāng)培養(yǎng)基（含20%血清）接種于培養(yǎng)基皿中置于37℃，5％ CO2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 06 24-48h后去懸浮，接下來的每3天換液一次，直到需要傳代。 骨組織消化法 ✦ 骨組織消化法操作簡(jiǎn)單、成本低，且獲得的BMSCs純度較貼壁篩選法高，是分離BMSCs較為常用的方法。 操作步驟 01 參照貼壁篩選法上述操作步驟第1-3步，收集沖去骨髓的股/脛骨于無菌的培養(yǎng)皿中，用無菌眼科剪小心地將骨組織剪成約1～3mm3的碎片。 02 之后加入適量含1mg/mL Ⅱ型膠原酶的新鮮完全培養(yǎng)基（含5% FBS），于37℃搖床中振蕩消化 。 03 消化結(jié)束后離心，棄上清液，用PBS清洗兩次，然后將骨碎片接種于培養(yǎng)皿中，加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基（含20% FBS）淹沒骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 04 培養(yǎng)至72h后進(jìn)行首次半量換液。此后每3天換一次液。待貼壁細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增傳代。 使用骨組織消化法分離BMSCs也并非完美，II型膠原酶的消化可能影響B(tài)MSCs活性及增殖能力。 |
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