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分子生物學(xué)：PCR檢測技術(shù)操作步驟
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聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA為模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數(shù)量，以便進行結(jié)構(gòu)和功能分析。PCR檢測方法在臨床上快速診斷細菌性傳染病等方面具有極為重要的意義。 PCR為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。至今在世界范圍內(nèi)都有廣泛的應(yīng)用，作為生物學(xué)實驗的一個重要的方法，其有著不可估量的作用。 簡單來說分為以下三個步驟： ✦ DNA變性，加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。 引物與靶DNA退火，適當(dāng)降低溫度，使兩個引物分別結(jié)合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。 引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離后，又可作為模板與引物雜交，并且在DNA聚合酶的催化下，引導(dǎo)合成新的靶DNA鏈。如此反復(fù)進行以上3個步驟，即可使靶DNA片段指數(shù)性擴增。 具體操作步驟如下： ✦ 1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。 2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃ 保溫7min。 3.結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。 4.PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。 雖然，PCR技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但對于一個傳統(tǒng)實驗室，不但要滿足高科技的實驗設(shè)備，合理的空間布局等基本條件，一般還具有人員素質(zhì)專業(yè)性高、管理嚴(yán)謹度高、投入成本高、結(jié)果責(zé)任性高等特點。 |
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