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2280ke銅蟲 (小有名氣)
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獲得性再生障礙性貧血的造模研究
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再生障礙性貧血（ＡＡ）是一種常見的骨髓造血功能衰竭性疾病，常因暴露于有毒的化學(xué)物質(zhì)、藥物過(guò)量、射線輻射、病毒感染等損壞骨髓造血細(xì)胞及組織，引起外周血三系減少，出現(xiàn)嚴(yán)重的貧血、中性粒細(xì)胞減少癥和血小板減少癥等 ＡＡ 包括先天性 ＡＡ 以及獲得性 ＡＡ。先天性 ＡＡ 多與 ＦＡ 基因突變有關(guān)，而獲得性 ＡＡ 則多與造血干細(xì)胞（HSC）減少、造血微環(huán)境損傷和 Ｔ 淋巴細(xì)胞功能紊亂有關(guān)。目前，ＡＡ 的主要治療手段為免疫抑制治療以及造血干細(xì)胞移植治療。ＡＡ 動(dòng)物模型的建立對(duì)ＡＡ 發(fā)病機(jī)制的研究及有效藥物的篩選具有重要意義。獲得性 ＡＡ 為最常見的全血減少性疾病，可有出血、貧血、感染等癥狀。主要的發(fā)病機(jī)制為HSC受損、造血微環(huán)境異常和免疫功能紊亂，針對(duì)以上３種發(fā)病機(jī)制，大體有以下幾種建立獲得性 ＡＡ 動(dòng)物模型的方法。 造模方法 物理方法 輻射作用于機(jī)體后，最早出現(xiàn)形態(tài)變化的是造血系統(tǒng)，由于骨髓組織增殖旺盛，分化程度低，對(duì)放射線高度敏感，骨髓損害程度取決于放射劑量的大小、照射范圍、部位和照射時(shí)間等。射線輻射除了損傷造血干細(xì)胞外，還可損傷造血微環(huán)境，影響干細(xì)胞的增殖和分化。射線能阻止 DNA 的復(fù)制而抑制細(xì)胞有絲分裂，減少造血干細(xì)胞數(shù)量，其微環(huán)境的改變往往在相當(dāng)時(shí)間內(nèi)得不到恢復(fù)。同時(shí)引起免疫功能的嚴(yán)重?fù)p傷。 射線輻射復(fù)制 AA 動(dòng)物模型多采用60 Co-γ 射線照射，60 Co-γ 射線輻射能夠誘發(fā)產(chǎn)生自由基，促進(jìn)造血細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期紊亂，造血干、祖細(xì)胞數(shù)量和增殖能力下降，造成骨髓損傷。但近十年來(lái)鮮有單獨(dú)采用射線照射的方法來(lái)進(jìn)行 AA 的模型制作。因其需要特殊設(shè)備，特殊防護(hù)，操作不方便，輻射劑量難以控制，過(guò)小達(dá)不到骨髓永久性損傷要求，過(guò)大又會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物死亡，有時(shí)藥物的作用難以觀察。所以現(xiàn)在射線照射多與化學(xué)藥物相結(jié)合進(jìn)行造模。 化學(xué)方法 苯劑作為最早應(yīng)用于 ＡＡ 造模的試劑之一，可導(dǎo)致多品系小鼠造血功能異常，多用于研究苯中毒后 骨髓造血衰竭動(dòng)物模型。苯在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞，使之不能分泌促進(jìn)造 血細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子；同時(shí)影響造血細(xì)胞的生長(zhǎng)、基因表達(dá)和凋亡。隨著研究的不斷進(jìn)展，越來(lái)越多的化學(xué)試劑用于建立獲得性 ＡＡ動(dòng)物模型。 分別于第 1、3、8、11、15、18、21、23 天，給予BALB/c 小鼠腹腔注射白消安 10.50 mg /kg，每天 1 次，共 8 次，造成小鼠骨髓長(zhǎng)期抑制模型，該模型骨髓造血功能不能恢復(fù)正常，從造模后第 1 天直至造模后第 112 天，外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板數(shù)、骨髓有核細(xì)胞數(shù)以及紅系、粒單系、淋巴系造血祖細(xì)胞數(shù)均低于正常。此方法導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)造血干細(xì)胞功能缺陷，可建立骨髓永久性抑制(再生障礙性貧血) 小鼠模型。 白消安是在臨床上廣泛用于異體骨髓移植后的藥物，然而，若使用不當(dāng)，其血液毒性會(huì)引起骨髓衰竭。同理，環(huán)磷酰胺也因其細(xì)胞毒性在一些情況下可引起ＨＳＣ受損等。有研究者采用連續(xù)１２ｄ環(huán)磷酰胺聯(lián)合白消安腹腔注射雄性ICR小鼠的方法建模。結(jié)果顯示ＡＡ組白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板以及骨ＢＭＮＣ分別下降了64.32％、42.3％、20.04％、61.53％和68.35％；骨髓組織可見脂肪細(xì)胞、巨核細(xì)胞等非造血細(xì)胞替代造血細(xì)胞。相比于對(duì)照組，骨髓組織中的ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＦＬＴ－３Ｌ蛋白水平明顯增加。結(jié)果基本符合ＡＡ 標(biāo)準(zhǔn)。該方法操作簡(jiǎn)便不復(fù)雜，但長(zhǎng)期腹腔注射，容易引起小鼠腹腔出血。 免疫介導(dǎo)方法 目前免疫介導(dǎo)的模型主要有２種方法：病毒感染和淋巴細(xì)胞輸注。 病毒可以作為抗原激活 T 淋巴細(xì)胞增殖，并識(shí)別具有抗原表達(dá)的造血干細(xì)胞而發(fā)生自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致骨髓衰竭; 也可能病毒直接破壞造血干細(xì)胞或同時(shí)感染骨髓基質(zhì)細(xì)胞，破壞造血微環(huán)境而影響骨髓的造血功能。通過(guò)病毒感染制作再生障礙性貧血?jiǎng)游锬Ｐ瓦@方面所進(jìn)行的研究較少，目前的報(bào)道有通過(guò)用巨細(xì)胞病毒和人類微小病毒 B19 持續(xù)感染小鼠，出現(xiàn)骨髓網(wǎng)狀間充質(zhì)細(xì)胞的缺失及骨髓功能損害。但同一病毒感染不同品系小鼠所介導(dǎo)的 AA 動(dòng)物模型機(jī)制不同，此方法操作復(fù)雜，較難掌握。 目前免疫介導(dǎo)的 AA 動(dòng)物模型大多通過(guò)淋巴細(xì)胞輸注。BALB /c 小鼠作為受者，DBA /2 小鼠為淋巴細(xì)胞供者。無(wú)菌取DBA /2 小鼠胸腺及淋巴結(jié)，分別獲得胸腺、淋巴結(jié)細(xì)胞懸液，活細(xì)胞 ＞ 95% ，胸腺細(xì)胞與淋巴結(jié)細(xì)胞以 1: 2 比例混合成為胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞懸液。BALB /c 小鼠經(jīng) 5 Gy 60Co-γ 射線全身照射(劑量率125． 35 cGy /min) ，照射后 20 小時(shí)內(nèi)由尾靜脈注入DBA /2 小鼠胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞懸液。小鼠照射后立即移入 SPF級(jí)無(wú)菌層流室內(nèi)，飲用加有慶大霉素( 40 萬(wàn) U /L) 和二性霉素 B ( 50 mg /L) 高壓滅菌水，觀察并記錄小鼠情況，28 天存活率 18.2%。此方法所制作的動(dòng)物模型與人再障時(shí)表現(xiàn)相似。 物理化學(xué)方法 物理合并化學(xué)藥物造模是目前比較新穎的造模方式，造模方法是將BALB/C小鼠先給予3.0Gy 137Cs γ射線照射（91cGy/min）約3min，2d后進(jìn)行腹腔注射環(huán)磷酰胺25mg·kg-1·d-1、氯霉素 62.5mg·kg-1·d-1，共計(jì)3d。其造模結(jié)果顯示，其WBC、RBC、PLT、Hb計(jì)數(shù)均較空白組顯著下降，與空白組比較，第7天模型組的骨髓有核細(xì)胞數(shù)顯著下降（P<0.05），骨髓病理切片抽檢 顯示各模型組骨髓中均有不同程度的造血細(xì)胞減少、脂肪細(xì)胞等非造血細(xì)胞增多。本模型造模時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，但存在輻射劑量和化學(xué)藥物劑量較難以控制，以及模型血象后期是否 穩(wěn)定仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行完善。 模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) AA 動(dòng)物模型判斷標(biāo)準(zhǔn): 外周血三系細(xì)胞減少、網(wǎng)織紅細(xì)胞減少，骨髓活檢示骨髓增生不良或低下、非造血細(xì)胞(脂肪細(xì)胞) 增多。臨床上，再生障礙性貧血的血象降低首先是血小板減低。在再障診斷中，骨髓巨核細(xì)胞是一個(gè)非常重要的指標(biāo)，如果患者骨髓中能見到較多的巨核細(xì)胞就可以直接除外再障。在再障血象恢復(fù)時(shí)血小板上升最慢，部分病人血色素和白細(xì)胞都正常了，但是血小板終身不恢復(fù)。因此建議在 AA 動(dòng)物模型評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)中增加對(duì)骨髓巨核細(xì)胞數(shù)減少的檢測(cè)。 小結(jié) 獲得性AA發(fā)病機(jī)制主要為骨髓造血干細(xì)胞異常、造 血 微 環(huán) 境 異 常、免 疫 異 常。采用物理、化學(xué)免疫等介導(dǎo)的方法，通過(guò)以上３種機(jī)制影響機(jī)體造血功能。其中，以淋巴細(xì)胞輸注制作的獲得性 ＡＡ 動(dòng)物模型與人類 ＡＡ 最為相似，應(yīng)用最為廣泛。所以，此種方法制作的模型最具有研究前景。 綜上，幾種 ＡＡ 動(dòng)物模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，但均存在 ＡＡ 期小鼠不穩(wěn)定性，以及外周血三系下降不一致等問(wèn)題，希望以后能在現(xiàn)有造模方法優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)之上，建立更加穩(wěn)定、有效的模型制備方法。 |
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