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小柴不拆
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動物建模| 盤點肺動脈高壓的幾種建模方法
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肺動脈高壓 ( PAH) 指肺動脈壓力異常升高的一種血流動力學和病理生理狀態(tài)，是一種致命性心肺疾病，最新流行病學數(shù)據(jù)顯示特發(fā)性和遺傳性 PAH 發(fā)病率為每百萬居民 5 例，患病率為每百萬居民 25 例，并且逐年增加趨勢明顯。 PAH 發(fā)病機制非常復(fù)雜，涉及炎癥、氧化應(yīng)激和代謝轉(zhuǎn)換等機制，盡管對 PAH 及其發(fā)生機制研究取得了很大進展，但目前最先進的治療方法仍然不能靶向正在進行的重構(gòu)過程，而是通過調(diào)控涉及維持血管張力的信號通路來治療PAH，5 年生存率只有 57%。 按臨床、治療和病理生理學特點，肺動脈高壓分為5類：動脈型PAH、左心疾病導致的PAH、肺病或缺氧導致的PAH、肺動脈阻塞導致的PAH、未知因素導致的PAH。盡管不同亞類PAH的病因不同，但都表現(xiàn)出相似的病理變化，包括肺血管內(nèi)側(cè)肥大、內(nèi)膜增生和纖維化、外膜增厚伴隨中度血管周圍炎癥細胞浸潤、叢狀擴張性病變以及原位血栓形成，肺血管不斷增生、重構(gòu)使血管部分閉塞，肺血管阻力增加，導致進行性右心衰竭和功能衰退，甚至死亡 。 精確闡明 PAH 發(fā)病機制，尋找新的有效治療策略一直是臨床的迫切需求和研究 熱點，而動物模型是實現(xiàn)這一目標的基礎(chǔ)。然而，目前還沒有一種 PAH 動物模型能夠復(fù)制 PAH 的所有特征，包括血液動力學改變和組織學重構(gòu)。今天我們就來盤點一下常用的PAH動物造模方法及優(yōu)劣勢，幫助你根據(jù)研究方向來選擇合適的造模方法。 造模方法 野百合堿誘導模型 野百合堿（MCT）是從野百合種子中提取的一種吡咯烷生物堿，它能夠引起肝毒性和肺動脈高壓。MCT 必須在體內(nèi)經(jīng)肝臟細胞色素 P450 3A4 代謝成毒性代謝物野百合吡咯( MCTP) ，野百合吡咯可以在肺血管內(nèi)皮細胞中形成DNA 和蛋白加合物，從而導致細胞周期停滯，使內(nèi)皮細胞凋亡，血管內(nèi)膜剝脫，從而引起肺動脈平滑肌細胞進行性增殖和肺血管重塑 。 MCT模型的特征在于內(nèi)皮細胞凋亡和血管周圍炎癥，這與人肺動脈高壓發(fā)病的生理病理機制類似。MCT模型能夠更好地幫助我們了解肺血管重塑的過程以及炎癥反應(yīng)在其發(fā)病機制的重要作用。 具體方法： 首選大鼠，經(jīng)頸背部或腹部單次皮下注射 １％ＭＣＴ溶液， 廣泛采用的劑量主要有50 mg·kg -1 和60mg·kg-1，一般2-3周后造模成功。ＭＣＴ 誘導的肺動脈高壓程度取決于 ＭＣＴ 的劑量 。 實驗原理： MCTP 在血漿等水溶液中快速降解(半衰期為3-4 s) ，但它可以在紅細胞中積累和轉(zhuǎn)運，保留了與肺組織相互作用的能力，這種作用導致內(nèi)皮細胞損傷，并于數(shù)周后進展為 PAH。肺內(nèi)皮細胞被認為是 MCTP 的特異性靶點，MCTP 能與內(nèi)皮細胞膜發(fā)生特異性交聯(lián)，直接導致內(nèi)皮細胞功能受損。因此，內(nèi)皮細胞是最早發(fā)生病變的細胞。 在 MCT 給藥后 9 -24 h 內(nèi)皮細胞發(fā)生改變，病變以內(nèi)皮細胞腫脹、胞質(zhì)囊化、胞漿不規(guī)則增厚、溶解為特征，并隨時間推進而進展，最終擴展到肺血管的各級血管，其中毛細血管和小動脈 更為嚴重。毛細血管膜的通透性增加，此時出現(xiàn)血小板和纖維蛋白血栓栓塞，大量的小血管管腔被部分或完全阻塞。中膜改變發(fā)生在內(nèi)膜改變之后，其特征是平滑肌肥大、增生，平滑肌延伸至正常非肌化的末梢小動脈。細胞外基質(zhì)( 膠原蛋白、彈力蛋白) 含量增加，并與增殖的平滑肌細胞共定位。外膜水腫和炎癥細胞浸潤，晚期見成纖維細胞增殖、膠原沉積、出血等。 在血管重構(gòu)過程中伴隨平滑肌細胞遷移、新內(nèi)膜形成、平滑肌細胞肥大和結(jié)締組織過度形成。小動脈重構(gòu)發(fā)生在中、大動脈之前，且小動脈中膜增厚程度要大于大動脈。此過程伴隨著肺血管阻力和肺動脈壓力持續(xù)增加，其嚴重程度隨時間推移和MCT 劑量增加而進展。炎癥、氧化應(yīng)激、代謝重編程等參與了 MCT PAH 模型機制調(diào)控，涉及 p38 MAPKα、NF- κB、PI3K/Akt /mTOＲ、NO 等信號路徑。 造模評價 通過血流動力學指標判斷模型是否成功，主要指標有肺動脈平均壓力、右心室收縮壓、右心室肥厚指數(shù)。ＭＣＴ 模型具有技術(shù)簡單、可重復(fù)、時間短、穩(wěn)定性好、低成本等優(yōu)點。ＭＣＴ 能引起內(nèi)皮功能障礙，較好模擬臨床上炎性相關(guān)的 ＰAＨ，但對重度血管增生性 ＰAＨ 的 模擬有限。另 外，ＭＣＴ 誘導的大鼠通常死于 ＭＣＴ 誘導的肺毒性、靜脈阻塞性肝病和心肌炎，而不是死于肺動脈高壓 。由于 ＭＣＴ 模型形態(tài)學變化發(fā)展得非�？觳⑶也灰淄ㄟ^治療干預(yù)來預(yù)防， 所以作為臨床 ＰAＨ 模型還具有一定的局限性。 MCT 誘導的 PAH 大鼠模型能夠模擬人類 PAH 的幾個關(guān)鍵方面，包括血管重構(gòu)、內(nèi)皮功能障礙、平滑肌細胞增殖、炎性細胞浸潤和右心室衰竭。該模型只需要單次藥物注射，且成本低廉，易于重復(fù)。其不足之處是不能模擬嚴重 PAH 病理學的關(guān)鍵特征———新內(nèi)膜和叢狀病變，以及隨時間推移而 PAH 可逆( 4 周后) ，易用藥物預(yù)防或治愈。 低氧誘導型 低氧性肺動脈高壓是臨床常見的一類PAH，常由慢性呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性阻塞性肺疾病、睡眠呼吸暫停、高原病等導致。慢性缺氧會引起內(nèi)皮細胞損傷，以致相關(guān)舒縮因子失衡，增加肺血管收縮反應(yīng)并促進血管重塑，最終發(fā)展為肺動脈高壓。近年來缺氧性肺血管收縮和肺動脈重塑的研究主要側(cè)重于內(nèi)皮素-１、一氧化氮、環(huán)氧合酶和腺嘌呤核苷酸途徑。 方案一：將動物置于低氧艙內(nèi)，通入N2和O2混合氣體，通過控制器將O２ 濃度控制在（10.0 ± 0.5）％（體積分數(shù)），缺氧時長2-8周，喂養(yǎng)期間定期清掃并補充食物和水。大量研究證明，持續(xù)缺氧或間斷性缺氧（約8ｈ·ｄ-1）均可發(fā)展為ＰＨA，并且低壓低氧艙或常壓低氧艙也均可成功制備模型。 方案二：將動物置于常壓低氧高二氧化碳氧倉中，倉內(nèi)氧濃度維持在 ９％-11％ ，二氧化碳濃度維持在 ５％ -６％ ，每天8ｈ，每周6ｄ，飼養(yǎng)4周 。吸入低氧伴高二氧化碳混合氣體制備PＨA 動物模型更符合臨床患者情況 。慢性高碳酸血癥常見于缺氧性肺病患者，并且根據(jù)臨床觀察，除非同時存在高碳酸血癥，否則低氧性肺病很難發(fā)展為肺動脈高壓，可見二氧化碳分壓與肺動脈壓力密切相關(guān)。 造模評價 通過慢性缺氧誘導肺動脈高壓，易于操作，最常用的動物是大鼠和小鼠。但慢性缺氧反應(yīng)在物種間存在差異，即使是同一物種隨著年齡、性別的不同，反應(yīng)也會受到顯著影響，最常用的動物是大鼠和小鼠。由于缺氧誘導是可逆的，因此較難模擬臨床重癥ＰＨA，并且不能完全模擬 ＰＨA 的血管損傷情況。盡管如此，這兩種模型都為體內(nèi)研究 ＰＨA 發(fā)病機制提供重要的疾病模型。 肺栓塞模型 肺栓塞是由內(nèi)源或外源性栓子阻塞肺動脈，引起肺循環(huán)和右心功能障礙的臨床綜合 征 。慢性血栓栓塞型肺動脈高壓是PＨA 的一種獨特形式，是急性肺栓塞或肺動脈原位血栓形成的長期后果，表現(xiàn)為肺動脈增大、內(nèi)膜受損及周圍血管阻塞 。 具體方法 此模型有2種方法：注射血栓或者異物。 注射血栓：血栓模型是從自體或供體（異源）動物獲得血液樣本在體外凝結(jié)成血栓，然后再將其注入實驗動物中。注射血栓可較好表現(xiàn)急性肺栓塞的病理生理情況，但是由于離體血凝塊的大小和體積均不規(guī)則，難以保證肺血管阻塞的程度和持續(xù)性，而且自體肺栓塞模型還需要進行2次手術(shù)，在大鼠、兔或豬中會產(chǎn)生循環(huán)休克，操作復(fù)雜。 注射異物：將惰性材料注入頸靜脈的方法來模擬肺栓塞，包括大鼠、兔、狗、羊、貓、豬都可以建立 慢性血栓栓塞肺動脈高壓模型。將體質(zhì)量（35-0-500ｇ的大鼠，通過右頸靜脈注射聚苯乙烯微球（15-25 μｍ，130萬-195萬個珠／100ｇ）。該方法可以控制進入肺部的微球數(shù)量，較準確地增加肺血管阻力，還避免發(fā)生免疫反應(yīng)、大鼠纖維蛋白溶解率高等問題。但也有一定的局限性，微球是阻塞在肺部毛細血管前小動脈中，而不是臨床上通常觀察到的阻塞在近端肺動脈。 造模評價 栓塞性ＰＨA 模型引起的血流動力學變化與臨床一致，產(chǎn)生的促凝狀態(tài)、血栓前變化可作為臨床避免血栓栓塞及外科手術(shù)等干預(yù)機制的實驗對象。 手術(shù)分流模型 肺動脈高壓是先天性心臟病的常見并發(fā)癥，高肺血流量引起的肺血管重構(gòu)是其重要的病理過程。 建模方法 手術(shù)分流可以增加肺部血流量，其中體循環(huán)動脈⁃肺動脈之間的分流和動⁃靜脈之間的分流是較常用的左向右分流型肺動脈高壓建模方法。 方案一：體循環(huán)動脈⁃肺動脈之間的分流 由于大、中動脈壓力高于肺動脈壓力，通過壓力階差在兩者間建立分流可使體循環(huán)血液分流至肺循環(huán)，使肺循環(huán)血液增多。該方法多采用犬、豬、羊等大型動物。包括誘導主動脈和肺動脈、左頸總動脈和肺動脈、左鎖骨下動脈和肺動脈分流等。盡管能更好的模擬臨床上慢性心臟病相關(guān)的PAH，但由于開胸手術(shù)難度較大、創(chuàng)傷大、飼養(yǎng)大體積動物困難及成本等問題，因此較難推廣和應(yīng)用。 方案二：動⁃靜脈（Ａ⁃Ｖ）之間的分流 利用動靜脈間較大的壓力差，分流后動脈血流入靜脈，使流回右心的血液增加，繼而使右心射入肺動脈的血液增多。該方法多采用兔、鼠等小型動物。大鼠多采用主動脈-腔靜脈分流；兔多采用頸總動脈-頸靜脈分流；有研究首創(chuàng)通過腹主動脈-下腔靜脈分流建立小鼠的PAH模型 ，小鼠模型為研究PAH的分子機制提供了更多機會。Ａ-V分流具有死亡率低、侵入性低、通暢性較高、成本低等優(yōu)點。 造模評價 隨著 PAH 機制研究從單純的血管收縮轉(zhuǎn)變?yōu)檠茉錾�，血液分流的作用被認為在PAH的發(fā)展中至關(guān)重要。 遺傳修飾模型 由遺傳因素導致的肺動脈高壓稱為遺傳性肺動脈高壓 ，主要有家族性肺動脈高壓（FPAH）和伴基因突變的特發(fā)性肺動脈高壓（IPAH）。 過去的研究中科學界不斷揭示PAH相關(guān)基因：BMPR2、ALK1、ENG、SMAD9、SMAD1、CAV1、KCNK3、TBX4、E2F2AK4、GDF2 、ATP13A3、AQP1、SOX17等，增強了對 PAH復(fù)雜遺傳基礎(chǔ)的理解。 基因敲除模型 據(jù)文獻報道，約有70-80%的 FPAH和10%-20% 的IPAH病例是由BMPR2突變引起的。有研究證明 BMPR2突變類型與PAH敏感性之間存在基因型⁃表型關(guān)系。去除外顯子 4、5的BMPR2 基因敲除小鼠會表現(xiàn)出輕度 PAＨ，損害肺血管系統(tǒng)對長時間低氧的重塑能力。還有去除第2個外顯子的 ＢＭ-PM2 基因敲除小鼠，這種小鼠對低氧反應(yīng)性增加。除此之外，有研究采用平滑肌特異性強力霉素誘導 ＢＭＰＲ２ 第899位氨基酸的突變，產(chǎn)生了非常接近人類的ＰAＨ。 除了ＢＭＰＲ２ 基因敲除模型，還有其他基因敲除模型，如敲除血管活性腸肽的小鼠（VIP-/-） 自發(fā)形成中度至重度PAH；敲除載脂蛋白E的小鼠（APOE -/－）可自發(fā)為PAH并伴有肺動脈肌肉化；內(nèi)皮素受體B（ETB）敲除模型，當內(nèi)皮素受體表達降低會增加肺內(nèi)皮素水平，從而促進PAH。 基因過表達模型 ５-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白的過度表達是ＰAＨ形成過程中的關(guān)鍵因素。首個５⁃HTT過表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型是通過一個人工染色體對５⁃HTT的C端血凝素抗原決定簇和內(nèi)部核糖體進入位點的一個 lacZ報告基因進行修飾。之后有研究采用平滑肌啟動子SM22建立５⁃HTT基因過表達模型（SM22-５⁃HTT＋），這種小鼠肺部鉀離子通道表達水平降低，并且５⁃HTT 表達增加的水平非常接近于人ＰAＨ 。 常用的還有過表達白細胞介素６（IL-6）的轉(zhuǎn)基因小鼠，對研究 IL-6在ＰＨ 發(fā)展中的作用以及抗炎方面發(fā)揮重要作用。有研究采用過表達血管生成素１（Ang-1）建立大鼠轉(zhuǎn)基因模型，Ang-1 的表達水平與PAH的嚴重程度成正比。研究表明大約５％ 的S100A4/Mts-1過表達的小鼠發(fā)生肺血管重塑，可觀察到其他模型沒有的叢狀病變。 造模評價 利用基因工程技術(shù)制備PAH模型，能從動物整體水平研究目的基因的表達調(diào)控規(guī)律，加深了我們對PAH病理生物學及治療學的認識，但是該方法存在技術(shù)難度大、動物模型品系過少（主要是小鼠）等缺點，仍需進行多方位的改進。 圖片 小結(jié) PAH動物模型的發(fā)展主要經(jīng)歷了2個階段，第1階段是肺動脈非特異性內(nèi)膜和外膜增厚，主要包括經(jīng)典模型（即低氧和MCT）；第2階段是發(fā)生叢狀病變，血管逐漸閉塞，肺動脈壓進行性升高，即手術(shù)分流、栓塞模型、遺傳修飾造模。 我們通過研究中的不同動物模型，同時重點關(guān)注它們與 PAH患者的相關(guān)性， 來幫助科研工作者根據(jù)疾病的不同階段選擇合適的動物模型，取得理想的造模效果。同時，也為進一步闡明PAH的病理機制、提高PAH患者的預(yù)后、探索新的治療靶點提供基礎(chǔ)。 來源：孫姝嬋,方蓮花,杜冠華.肺動脈高壓動物模型研究進展[J].中國藥理學通報,2020,36(08):1037-1040. |
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