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吉田bio銅蟲 (小有名氣)
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免疫性腦脊髓炎動物模型
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免疫性腦脊髓炎動物模型 免疫性腦脊髓炎動物模型主要用于人類多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS）的研究。 MS是一種在西方國家發(fā)病率很高的自身免疫性疾病。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(exper imental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的病理變化與發(fā)病機制與急性MS極其相似。因此，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)為目前國際公認的MS動物模型。成功的建立EAE模型對MS的研究有很重要的作用。 （一）自發(fā)性及轉(zhuǎn)基因動物模型 近年來人們發(fā)現(xiàn)小鼠更易通過雜交系或利用基因敲除技術(shù)制作具有特殊遺傳基因背景的品系，用于MS/EAE免疫訓節(jié)機制障礙的研究。例如，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)受體基因缺陷小鼠較同系野生型小鼠 EAE模型脫髓鞘和軸索損傷程度輕，說明TNF-a是介導脫髓鞘和軸索損傷的重要細胞因子；又如MHCI類基因缺陷的C57BL/6 基因敲除小鼠，用寡樹突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG）或含脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein,PLP）不能誘發(fā) EAE，這可能是由于其不具有同系野生型小鼠處理和提呈這些髓鞘抗原的能力。 （二）誘發(fā)性動物模型 EAE模型按臨床病程通常分為4型： 1.急性單相(AM)型 常用髓鞘素抗原如髓鞘素堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、含脂質(zhì)蛋白(PLP)免疫 Lewis 大鼠，或用寡樹突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)35-55 多肽片段免疫B6小鼠，也可通過MBP或其多肽片段致敏的T淋巴細胞系被動轉(zhuǎn)輸給正常大鼠誘發(fā)，病程短，以急性腦脊髓炎病變?yōu)橹�，脫髓鞘較輕，可完全恢復。 2.復發(fā)緩解(RR）型 一般為雙相病程（發(fā)病2次），可以自愈，用PLP免疫SJL小鼠是理想的RR型模型。 3.遷延復發(fā)(PR）型 也稱慢性復發(fā)(CR）型，病情較重，死亡率較前兩型高；RR與PR型不易誘發(fā)，常需一定品系動物如Lewis大鼠的某些亞系、DA大鼠或某些特殊基因背景的小鼠，并用特定的免疫原如MOG35-55多肽片段，有時需增加其他誘導方法，如轉(zhuǎn)輸CD4+T細胞，注射抗髓鞘成分特異性抗體或致腦炎因子白細胞介素12等，此兩型EAE脫髓鞘及軸索損傷明顯，臨床表現(xiàn)與MS頗近似。 4.慢性進展(CP）型 【造模機制】用豚鼠脊髓勻漿(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH）作為實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎的抗原。等體積的GPSCH 和完全弗氏佐劑(complete freund's ad-juvant,CFA)混合后致敏動物，即可造成Wistar大鼠 EAE模型。 【造模方法】 1.動物選擇 根據(jù)動物對EAE的敏感性，制備模型主要選用的動物有C3H/HeJ,SJI/J,B10PL,PL/J小鼠，Hartley,Stisin13豚鼠及新西蘭白兔等。由于實驗研究的需要，大鼠 EAE模型的應用越來越多，目前報道較多的大鼠模型所用大鼠品系主要為對 EAE敏感的 Lewis 大鼠。國內(nèi)目前誘發(fā)大鼠 EAE模型的常用免疫原為自提取的DA大鼠脊髓勻漿(DA-SCH)或異種腦、脊髓勻漿，所用動物大多為 Lewis 大鼠、Wistar 大鼠或豚鼠。Wist-ar大鼠一直被認為對 EAE誘導具有抵抗性(EAE-resistant)。近年來，成功地誘導了 Wist-ar大鼠急性及復發(fā)性 EAE，推動了多發(fā)性硬化的動物實驗研究。國外越來越多的研究者應用不同的MOG 肽段或 DA-SCH為免疫原誘發(fā)緩解-復發(fā)型模型，以更好模擬人類MS的發(fā)病過程。其中 MOG35-55及DA-SCH漿組為緩解-復發(fā)型，更接近于人類 MS的發(fā)病過程，具有更廣的應用前景。儀器藥品：顯微鏡、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、百日咳疫苗（BPV）等。 2.模型制作 取豚鼠2只，麻醉后經(jīng)心灌注生理鹽水至沖出液為無色，迅速取出脊髓去除脊膜，稱重后放入組織研磨器，加入等量生理鹽水研磨成50%的豚鼠脊髓勻漿(GP-SCH）。將等體積的GPSCH和完全弗氏佐劑(CFA）混合，用注射器在冰上抽打，直至成為油包水乳劑，此即免疫抗原。以上過程均注意無菌操作�？乖灰吮４�，應立即使用。30只Wistar大鼠隨機平均分為3組：一次免疫組（A組），二次免疫組(B組)和生理鹽水對照組（C組）。其中A,B兩組大鼠用免疫抗原，0.4ml/只，C組給生理鹽水+等量CFA,.0.4m1l/只。給藥方式均為背部皮下注射，分為4點，每點 0.1ml。最后每組動物均在右足腳背皮內(nèi)注射 O.1ml百日咳疫苗(BPV）(約含2×100個菌體）。接種抗原后第15天，將等體積的GPSCH 和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant,IFA)混合成油包水乳劑，用同樣方法給B組注射。 3.觀察指標 每天觀察動物的飲食、活動情況及體重。EAE評分采用如下標準。0分：動物無任何癥狀；1分：動物尾部無力或步態(tài)輕度笨拙；2分：動物尾部無力十后肢無力，人為將鼠翻倒后能夠復位；3分：肢體完全癱瘓，人為翻倒后不能復位；4分：瀕死狀態(tài)或死亡。A,B兩組動物于各自發(fā)病高峰期，C組動物于實驗后2周，全部處死，常規(guī)甲醛 PBS溶液經(jīng)心全身灌注固定，取出大腦，再浸泡固定1天，作冷凍切片(厚5μl)。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。 【模型特點】復制模型表現(xiàn)為，少食消瘦、委靡發(fā)燒、肢體癱瘓、尿便障礙、重則抽搐死亡。病理觀察可見，腦脊髓表靜脈充盈。腦和脊髓彌漫性水腫。腦脊髓膜充血，脊髓各段小血管周圍有大量單核、淋巴細胞浸潤，形成典型的“血管套”。血管內(nèi)膜增厚，管腔變小，炎癥細胞浸潤，部分有神經(jīng)膠質(zhì)增生，Weils髓鞘染色，腦內(nèi)髓鞘斷裂和崩解，嚴重的有廣泛的神經(jīng)髓鞘變性、脫失，但軸突相對完整，以腦干和脊髓等為著，其中大多局限在炎癥改變明顯的血管套周圍的白質(zhì)區(qū)。 【注意事項】 1.應根據(jù)實際情況選擇易感動物造模 并注意動物的類型、品系、年齡、性別。 2.注意所用的抗原純度、類型、計量、物理形態(tài)和注射方法會影響實驗結(jié)果。 3.應用同一批次的佐劑及其他試劑。 【應用范圍】該模型是神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的一個十分有用的模型。主要用于研究人類多發(fā)性硬化癥的發(fā)病機制及藥物治療效果等。 |
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