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2280ke銅蟲 (小有名氣)
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蛋白檢測|那些不聽話的條帶，我該拿它怎么辦？
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辛辛苦苦，按部就班， 做完了大半實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)理想的結(jié)果 重來一遍？ 又不知道問題出在了哪里 我來回復(fù)那些關(guān)于條帶的問題，幫助你有效避坑。 當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期低或高是什么原因？如何解決呢？ ①當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期低： 原因：目的蛋白經(jīng)過剪切或降解，有相同或相似抗原表位的蛋白被抗體檢測出 解決辦法：樣品準(zhǔn)備時(shí)候要在冰上操作；加入更過蛋白酶抑制劑；更換別的抗體 ②當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期略高： 原因1：蛋白可能被糖基化，或氨基酸基被修飾 解決辦法：使用酶去除可能的蛋白修飾；檢查抗原序列 原因2：可能有融合蛋白 解決辦法：查看表達(dá)序列 原因3：蛋白形成二聚體或多聚體 解決辦法：加強(qiáng)變性條件 當(dāng)條帶比較模糊的時(shí)候，是什么原因？如何解決呢？ 原因：是否轉(zhuǎn)膜電壓過高；轉(zhuǎn)膜中是否有氣泡殘留；轉(zhuǎn)膜緩沖液組分問題 解決辦法：降低轉(zhuǎn)膜電壓，重新配制緩沖液，在電轉(zhuǎn)之前小心的移除膜和膠之間的氣泡 當(dāng)條帶分布不均勻，是什么原因？如何解決？ 原因：也可能孵育時(shí)振蕩不均勻，抗體和封閉液不結(jié)合 解決辦法：離心，分離二抗中的聚合體，確保孵育過程中膜完全浸沒在抗體中；孵育時(shí)確保震蕩均勻，嘗試更換封閉液分離膠聚合不均勻，導(dǎo)致蛋白電泳不一致：調(diào)整聚合條件，分離膠溶液混勻后再進(jìn)行聚合 轉(zhuǎn)膜后為什么條帶扭曲？大分子條帶扭曲？膠里的蛋白條帶沒事。 原因：大分子條帶扭曲可以多跑一會試試，看看上膠的時(shí)候是不是不均勻。注意轉(zhuǎn)膜時(shí)膠或者膜是否平整。 解決辦法：降低跑膠電壓，延長電泳時(shí)間 目的蛋白條帶是白色的，其余地方全是黑色，是什么原因？ 白色可能是濃度太高了，黑色是顯色液不足導(dǎo)致。 解決辦法：調(diào)整曝光參數(shù)重新曝光，或調(diào)整蛋白上樣量重新電泳 不帶標(biāo)簽的蛋白上樣后，利用抗his標(biāo)簽單抗進(jìn)行孵育，然后出現(xiàn)條帶怎么辦？條帶還不是目的條帶，利用卡馬斯亮藍(lán)染色又沒有出現(xiàn)那個(gè)條帶是什么原因？ 單孵育二抗看看是不是非特異，考馬斯藍(lán)分辨率不夠，目標(biāo)蛋白不足，都會不出現(xiàn)條帶。 凝膠電泳整塊膠都有雜帶是什么原因？Marker孔看不出來，沒有加蛋白孔也有雜帶。 原因1：整塊膠都有雜帶可能是加太多溢出來了，marker孔看不出來加得少，確定一下梳子孔是不是壞了，還有可能是蛋白和抗體不結(jié)合 原因2：電泳液或其他緩沖液重復(fù)使用有蛋白污染，或其他接觸膜的試劑或設(shè)備有蛋白污染 解決辦法：更換緩沖液，清洗設(shè)備重新實(shí)驗(yàn)。 為什么邊孔的條帶要翹起來？ 一般不用最邊上的孔，它用來跑marker。辛辛苦苦，按部就班， 做完了大半實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)理想的結(jié)果 重來一遍？ 又不知道問題出在了哪里 今天小助手匯總了抖音粉絲私信過我們的那些關(guān)于條帶的問題，幫助你有效避坑。 當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期低或高是什么原因？如何解決呢？ ①當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期低： 原因：目的蛋白經(jīng)過剪切或降解，有相同或相似抗原表位的蛋白被抗體檢測出 解決辦法：樣品準(zhǔn)備時(shí)候要在冰上操作；加入更過蛋白酶抑制劑；更換別的抗體 ②當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期略高： 原因1：蛋白可能被糖基化，或氨基酸基被修飾 解決辦法：使用酶去除可能的蛋白修飾；檢查抗原序列 原因2：可能有融合蛋白 解決辦法：查看表達(dá)序列 原因3：蛋白形成二聚體或多聚體 解決辦法：加強(qiáng)變性條件 當(dāng)條帶比較模糊的時(shí)候，是什么原因？如何解決呢？ 原因：是否轉(zhuǎn)膜電壓過高；轉(zhuǎn)膜中是否有氣泡殘留；轉(zhuǎn)膜緩沖液組分問題 解決辦法：降低轉(zhuǎn)膜電壓，重新配制緩沖液，在電轉(zhuǎn)之前小心的移除膜和膠之間的氣泡 當(dāng)條帶分布不均勻，是什么原因？如何解決？ 原因：也可能孵育時(shí)振蕩不均勻，抗體和封閉液不結(jié)合 解決辦法：離心，分離二抗中的聚合體，確保孵育過程中膜完全浸沒在抗體中；孵育時(shí)確保震蕩均勻，嘗試更換封閉液分離膠聚合不均勻，導(dǎo)致蛋白電泳不一致：調(diào)整聚合條件，分離膠溶液混勻后再進(jìn)行聚合 轉(zhuǎn)膜后為什么條帶扭曲？大分子條帶扭曲？膠里的蛋白條帶沒事。 原因：大分子條帶扭曲可以多跑一會試試，看看上膠的時(shí)候是不是不均勻。注意轉(zhuǎn)膜時(shí)膠或者膜是否平整。 解決辦法：降低跑膠電壓，延長電泳時(shí)間 目的蛋白條帶是白色的，其余地方全是黑色，是什么原因？ 白色可能是濃度太高了，黑色是顯色液不足導(dǎo)致。 解決辦法：調(diào)整曝光參數(shù)重新曝光，或調(diào)整蛋白上樣量重新電泳 不帶標(biāo)簽的蛋白上樣后，利用抗his標(biāo)簽單抗進(jìn)行孵育，然后出現(xiàn)條帶怎么辦？條帶還不是目的條帶，利用卡馬斯亮藍(lán)染色又沒有出現(xiàn)那個(gè)條帶是什么原因？ 單孵育二抗看看是不是非特異，考馬斯藍(lán)分辨率不夠，目標(biāo)蛋白不足，都會不出現(xiàn)條帶。 凝膠電泳整塊膠都有雜帶是什么原因？Marker孔看不出來，沒有加蛋白孔也有雜帶。 原因1：整塊膠都有雜帶可能是加太多溢出來了，marker孔看不出來加得少，確定一下梳子孔是不是壞了，還有可能是蛋白和抗體不結(jié)合 原因2：電泳液或其他緩沖液重復(fù)使用有蛋白污染，或其他接觸膜的試劑或設(shè)備有蛋白污染 解決辦法：更換緩沖液，清洗設(shè)備重新實(shí)驗(yàn)。 為什么邊孔的條帶要翹起來？ 一般不用最邊上的孔，它用來跑marker。辛辛苦苦，按部就班， 做完了大半實(shí)驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)沒有出現(xiàn)理想的結(jié)果 重來一遍？ 又不知道問題出在了哪里 今天小助手匯總了抖音粉絲私信過我們的那些關(guān)于條帶的問題，幫助你有效避坑。 當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期低或高是什么原因？如何解決呢？ ①當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期低： 原因：目的蛋白經(jīng)過剪切或降解，有相同或相似抗原表位的蛋白被抗體檢測出 解決辦法：樣品準(zhǔn)備時(shí)候要在冰上操作；加入更過蛋白酶抑制劑；更換別的抗體 ②當(dāng)條帶出現(xiàn)位置比預(yù)期略高： 原因1：蛋白可能被糖基化，或氨基酸基被修飾 解決辦法：使用酶去除可能的蛋白修飾；檢查抗原序列 原因2：可能有融合蛋白 解決辦法：查看表達(dá)序列 原因3：蛋白形成二聚體或多聚體 解決辦法：加強(qiáng)變性條件 當(dāng)條帶比較模糊的時(shí)候，是什么原因？如何解決呢？ 原因：是否轉(zhuǎn)膜電壓過高；轉(zhuǎn)膜中是否有氣泡殘留；轉(zhuǎn)膜緩沖液組分問題 解決辦法：降低轉(zhuǎn)膜電壓，重新配制緩沖液，在電轉(zhuǎn)之前小心的移除膜和膠之間的氣泡 當(dāng)條帶分布不均勻，是什么原因？如何解決？ 原因：也可能孵育時(shí)振蕩不均勻，抗體和封閉液不結(jié)合 解決辦法：離心，分離二抗中的聚合體，確保孵育過程中膜完全浸沒在抗體中；孵育時(shí)確保震蕩均勻，嘗試更換封閉液分離膠聚合不均勻，導(dǎo)致蛋白電泳不一致：調(diào)整聚合條件，分離膠溶液混勻后再進(jìn)行聚合 轉(zhuǎn)膜后為什么條帶扭曲？大分子條帶扭曲？膠里的蛋白條帶沒事。 原因：大分子條帶扭曲可以多跑一會試試，看看上膠的時(shí)候是不是不均勻。注意轉(zhuǎn)膜時(shí)膠或者膜是否平整。 解決辦法：降低跑膠電壓，延長電泳時(shí)間 目的蛋白條帶是白色的，其余地方全是黑色，是什么原因？ 白色可能是濃度太高了，黑色是顯色液不足導(dǎo)致。 解決辦法：調(diào)整曝光參數(shù)重新曝光，或調(diào)整蛋白上樣量重新電泳 不帶標(biāo)簽的蛋白上樣后，利用抗his標(biāo)簽單抗進(jìn)行孵育，然后出現(xiàn)條帶怎么辦？條帶還不是目的條帶，利用卡馬斯亮藍(lán)染色又沒有出現(xiàn)那個(gè)條帶是什么原因？ 單孵育二抗看看是不是非特異，考馬斯藍(lán)分辨率不夠，目標(biāo)蛋白不足，都會不出現(xiàn)條帶。 凝膠電泳整塊膠都有雜帶是什么原因？Marker孔看不出來，沒有加蛋白孔也有雜帶。 原因1：整塊膠都有雜帶可能是加太多溢出來了，marker孔看不出來加得少，確定一下梳子孔是不是壞了，還有可能是蛋白和抗體不結(jié)合 原因2：電泳液或其他緩沖液重復(fù)使用有蛋白污染，或其他接觸膜的試劑或設(shè)備有蛋白污染 解決辦法：更換緩沖液，清洗設(shè)備重新實(shí)驗(yàn)。 為什么邊孔的條帶要翹起來？ 一般不用最邊上的孔，它用來跑marker。 |
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