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吉田bio銅蟲(chóng) (小有名氣)
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免疫功能低下癥動(dòng)物模型
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免疫功能低下癥動(dòng)物模型 【造模機(jī)制】環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)是強(qiáng)的免疫抑制劑，對(duì)多種免疫活性都有抑制作用，作為抗癌藥和免疫抑制劑在臨床廣泛使用，但在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也明顯損傷快速增殖的正常細(xì)胞，特別對(duì)免疫系統(tǒng)和造血功能產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害,對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫均有作用。環(huán)磷酰胺主要破壞 DNA的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而抑制 DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)胞分裂，致使免疫功能低下。 【造模方法】選用 ICR小鼠,（18±2）g,雌雄兼用。儀器藥品：分光光度計(jì)、熒光顯微鏡、環(huán)磷酰胺、綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、RPMI-1640培養(yǎng)液等。將 20只小鼠，按性別及體重隨機(jī)分成2組，每組10只,雌雄各半。正常對(duì)照組：生理鹽水 50mg/kg 行腹腔注射；模型組：Cy 50mg/kg 行腹腔注射。每日一次,連續(xù)2天。造模不同時(shí)間進(jìn)行下列指標(biāo)檢測(cè)： 1.血清中1gM的測(cè)定 給藥第1天每只鼠腹腔注射10% SRBCO.2ml 致敏，致敏后第5天，摘除眼球取血，把收集的血清作 800倍稀釋后，吸取 0.5ml 稀釋的血清放入另一試管中，依次加入10% SRBC、補(bǔ)體、生理鹽水各0.5ml，對(duì)照組用生理鹽水代替血清，混勻，置37℃溫箱溫育1小時(shí)，離心（3000r/min)5分鐘,取上清液用分光光度計(jì)（波長(zhǎng) 540nm)測(cè)OD值。 2.NK細(xì)胞活性測(cè)定 采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）：①效應(yīng)細(xì)胞制備：給藥5天后，斷頭取血，常規(guī)無(wú)菌制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液，用含 50ml/L小牛血清的Hank's液洗2次,1000r/min 離心10分鐘、于第2次離心后,棄去上清液，用含100ml/L牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10°個(gè)/ml:②粑細(xì)胞制備：實(shí)驗(yàn)前 24小時(shí)將靶細(xì)胞YAC1進(jìn)行傳代培養(yǎng),用前以 hank's液洗3次,用含 100ml/1.牛血清的 PR-MI-1640完全培養(yǎng)液重懸（活細(xì)胞數(shù)>95%），調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，使效靶比為20：1。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μ1加入96孔板中，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和不加效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞對(duì)照孔各3個(gè)復(fù)孔。每孔加入 MTT （5mg/ml)溶液10μl，置37℃、5%的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)，1500r/min 離心15分鐘，棄上清。每孔內(nèi)加入150μ1二甲基亞碩（DMSO），置振蕩儀上振蕩5分鐘，使 MTT還原產(chǎn)物甲聵（formazan）完全溶解，測(cè)定570nm處光吸收度（A值），結(jié)果以 NK活性表示，其計(jì)算方法為：NK活性（%）=1-（實(shí)驗(yàn)孔A均值-效應(yīng)細(xì)胞孔A均值）÷靶細(xì)胞孔 A均值×100%。 3.血清溶血素測(cè)定 采用免疫溶血法。于給藥第1天，每只小鼠腹腔注射0.2ml SR-BC致敏，致敏后第5天處死，用冷的Gey液制成脾細(xì)胞懸液(5×10°/L)，然后取試管若干支，每管依次加入牌細(xì)胞懸液、0.2% SRBC、1：10豚鼠血清各 0.5ml,另設(shè)不加補(bǔ)體的空白對(duì)照。置 37℃水浴1小時(shí)，離心（3000r/min)5分鐘，取上清液。用分光光度計(jì)（波長(zhǎng)413nm）測(cè)吸光度。 4.白介素 2(1L.-2）測(cè)定 經(jīng)眼眶取血,離心(3000r/min)20分鐘取血清。采用放射免疫方法測(cè)定各組小鼠血清IL-2含量。 5.T淋巴細(xì)胞亞群(CD4、CD8）測(cè)定 采用單克隆抗體(MCAB)間接免疫熒光法制作鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10/ml，每1×106細(xì)胞加入 100μ1 熒光抗體和1:5 稀釋 FIT 標(biāo)記抗鼠 IgG 抗體 100μl。4℃反應(yīng)30分鐘后在熒光顯微鏡下計(jì)算熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 【模型特點(diǎn)】Cy組小鼠血清中IgM水平明顯降低，NK細(xì)胞活性下降。溶血素值下降，血清中IL-2含量明顯減少，Cy模型組CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)及 CD4+/CD8+細(xì)胞比值均明顯低于正常對(duì)照組。 【注意事項(xiàng)】 1.Cy對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇性不高 超量或長(zhǎng)期使用會(huì)明顯降低機(jī)體的免疫力。鑒此用于中藥對(duì)于提高免疫功能低下癥的研究時(shí)一般預(yù)先給動(dòng)物服藥。 2.利用Cy復(fù)制免疫功能低下癥的動(dòng)物模型有多種方式如：大劑量一次給予的復(fù)制方式（100mg/kg或200mg/kg）、小劑量多次給予的復(fù)制方式（50mg/kg，每日一次，連續(xù) 2天；或40mg/kg，每日一次，連續(xù)3天）。應(yīng)根據(jù)具體情況選用合適的造模方法 【應(yīng)用范圍】該模型可用于中藥對(duì)于提高免疫功能低下癥的研究，亦可用于具有免疫調(diào)節(jié)作用的保健食品或藥品的功效研究。 |
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