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動(dòng)物建模 | 關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的建模方法研究
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動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為一種慢性炎癥性疾病，是由多種因素共同作用引起的，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。構(gòu)建AS動(dòng)物模型對于探究AS的病因、發(fā)病機(jī)制、防治和藥物研發(fā)具有重要意義。目前有關(guān)AS的發(fā)病機(jī)制的假說有：脂質(zhì)浸潤學(xué)說、鈣超載學(xué)說、內(nèi)膜損傷學(xué)說、免疫反應(yīng)學(xué)說等。雖然這些假說都從某一方面解釋了AS的發(fā)病機(jī)制，但這些假說并不能全面的闡述AS的發(fā)生、發(fā)展過程與機(jī)理。在AS的發(fā)展過程中，大量脂質(zhì)在血管中積累，鈣質(zhì)也在血管沉積從而導(dǎo)致血管鈣化、血管內(nèi)皮損傷，此變化加劇了脂質(zhì)的侵入和損傷，同時(shí)又有炎性因子引起的免疫反應(yīng)，多種因素共同作用導(dǎo)致AS。因此，為了深入探究AS的發(fā)病機(jī)制，構(gòu)建一個(gè)合適的AS動(dòng)物模型是非常重要的。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇 AS常用于研究該疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有：豬、猴、家兔、鵪鶉、大鼠和小鼠等。鼠類因其體型小、生存能力強(qiáng)、繁殖迅速、獲取容易等優(yōu)勢一直被作為臨床試驗(yàn)中應(yīng)用范圍最廣、應(yīng)用數(shù)量最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是ApoE基因敲除等轉(zhuǎn)基因小鼠被廣泛用于復(fù)制AS模型。其優(yōu)點(diǎn)為能自發(fā)形成AS，普食喂養(yǎng)便可形成嚴(yán)重的高脂血癥，高脂飲食喂養(yǎng)可加速斑塊的形成，且其斑塊的分布與人類AS的分布極為相似，但由于體型小、可獲得的血液樣本少等缺點(diǎn)無法進(jìn)行類似多指標(biāo)血液檢測等的實(shí)驗(yàn)研究。由于大鼠具有應(yīng)用范圍廣泛、體型較大、獲取容易、飼養(yǎng)方便、死亡率低、能夠獲取足夠的血液及其組織標(biāo)本等特點(diǎn)，越來越多研究學(xué)者更傾向于用大鼠來建立AS模型. 方法盤點(diǎn) 單純高脂飼料建立AS模型 大部分AS模型的建立都是基于大量的脂質(zhì)再結(jié)合其他方法共同構(gòu)建模型，血漿膽固醇水平與AS的產(chǎn)生呈正相關(guān)。因此，建模時(shí)的高脂飼料配方多以高比例的膽固醇、豬油等作為脂質(zhì)來源。高脂飼料配方多由1%~3%膽固醇、8%~10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、81.3%~85.3%普通飼料組成。純高脂飼料喂養(yǎng)法構(gòu)建AS模型的方法優(yōu)點(diǎn)是操作相對簡單。成本也比較低廉，但缺點(diǎn)就是動(dòng)物成模率較低，且造模周期也較長，無法形成穩(wěn)定的AS斑塊。因此大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究更傾向于在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用其他損傷操作，達(dá)到構(gòu)建模型更好更快的目的。 高脂飼料聯(lián)合維生素D建立AS模型 有研究者采用含1％膽固醇高脂飼料聯(lián)合維生素D3(700 000 U／kg) 的制備方法于飼養(yǎng)6周后成功建立穩(wěn)定、可重復(fù)的AS模型。另有研究者以高脂飼料為誘導(dǎo)聯(lián)合腹腔注射維生素D3注射液，6周后成功復(fù)制AS大鼠模型。AS模型大鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，泡沫細(xì)胞堆積，主動(dòng)脈內(nèi)膜介質(zhì)明顯厚于正常組的主動(dòng)脈內(nèi)膜，與正常組大鼠的AS病變比較，AS模型組病變明顯增加。 使用維生素D配合制備AS模型的方法有多種。常用腹腔注射法、灌胃或直接大劑量添加到飼料中，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求和目的自行選擇。高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合維生素D3，復(fù)制模型的實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作比較簡單，大鼠的整個(gè)AS發(fā)生發(fā)展過程比較穩(wěn)定．這種方法比較好地彌補(bǔ)了AS病變過程中里只有膽固醇沉積而少鈣沉積的缺點(diǎn)，是一種比較有效且常見的AS模型復(fù)制方法。 但是，采用此方法制備AS模型時(shí)對于維生素D的給藥劑量及給藥周期要求比較嚴(yán)格，給藥劑量太高或者過低都不利于模型的成功復(fù)制。劑量過高會(huì)導(dǎo)致大鼠厭食嚴(yán)重、體型消瘦、體重減輕甚至死亡，過低又不易形成AS典型病理狀態(tài)，因此。在造模過程中應(yīng)密切觀察動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲食情況和體重變化，結(jié)合自身的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行復(fù)制模型。但此造模方式耗時(shí)較長，要保持足夠的耐心。 高脂飼料聯(lián)合免疫炎癥建立AS模型 有研究者利用大鼠腹腔注射維生素D3和卵清白蛋白致敏，造成大鼠免疫炎癥，高脂飼料喂養(yǎng)14周后大鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)AS斑塊。但此方法尚在起步階段，許多方面不成熟，且此方法難免會(huì)對動(dòng)物產(chǎn)生免疫損傷等不良反應(yīng)。原理基于ROSS于1999年提出AS是一種炎癥性疾病，炎性細(xì)胞通過吞噬作用清除脂質(zhì)物質(zhì)，同時(shí)形成泡沫細(xì)胞，并形成脂質(zhì)沉積核心，引起AS斑塊的形成。 機(jī)械損傷法建立AS模型 1.球囊損傷術(shù) 球囊損傷術(shù)是制備血管損傷后再狹窄模型的常見方法，此方法的主要操作是將一定直徑大小的球囊放入動(dòng)脈血管后充盈球囊，通過反復(fù)拖拉充盈后的球囊造成動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成內(nèi)皮細(xì)胞的即刻脫落，彈力板及中膜嚴(yán)重?fù)p傷。引起局部血管狹窄。有研究者將高脂飼料喂養(yǎng)、維生素D，腹腔注射和球囊損傷術(shù)聯(lián)合應(yīng)用建立大鼠AS模型，給予大鼠1次性腹腔注射維生素D400 000 U／Kg，高脂喂養(yǎng)7d后進(jìn)行球囊手術(shù)，6周后造模成功。 進(jìn)行球囊損傷手術(shù)時(shí)需要注意選擇內(nèi)徑大小適宜的球囊，牽拉過程中速度、力度的把握以及對球囊擴(kuò)張壓力的控制。球囊擴(kuò)張?zhí)^、來回牽拉太快或操作人員用力過大都會(huì)容易造成動(dòng)脈的破裂，過度損傷；反之?dāng)U張不夠、牽拉過于緩慢又不能造成有效的內(nèi)膜損傷，所以建立成功的AS模型，球囊損傷術(shù)對操作人員技術(shù)要求比較高。在球囊損傷手術(shù)之后的3～5 d需密切觀察動(dòng)物狀態(tài)，還需腹腔注射青霉素鈉防止術(shù)后感染，造成不必要的死亡與損傷。 2.電擊損傷術(shù) 此方法原理為通過一定的電擊刺激可引起血管內(nèi)膜損傷，激活血小板，血小板聚集后會(huì)釋放出一些活性物質(zhì)，這些物質(zhì)則會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使其損傷加重，隨著時(shí)間的延長，可形成明顯的AS斑塊。有研究者利用高脂飼料及頸動(dòng)脈電擊損傷聯(lián)合作用制備AS模型．通過對影響因素的多次實(shí)驗(yàn)篩查，最終大鼠高脂飲食聯(lián)合腹腔注射維生素D，加頸動(dòng)脈電擊損傷(1 mA、5 min)復(fù)合因素所致的AS模型建立成功。 此手術(shù)方法對于電流強(qiáng)度與電擊時(shí)間要求比較嚴(yán)格，電流強(qiáng)度過大時(shí)容易造成動(dòng)脈血管壁出現(xiàn)比較明顯的焦灼痕且容易導(dǎo)致動(dòng)脈穿孔。電擊造成的損傷嚴(yán)重破壞動(dòng)脈血管壁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大鼠死亡率增高．這也是大多數(shù)研究者不常采用此方法的原因之一。 3.動(dòng)脈鉗夾術(shù) 手術(shù)動(dòng)脈鉗夾法的原理是機(jī)械壓迫阻斷動(dòng)脈正常供血，導(dǎo)致局部血管缺血缺氧，頸動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，引發(fā)炎性反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生。有研究者使用血管鉗夾住大鼠一側(cè)頸動(dòng)脈20 min，手術(shù)后以高脂飲食喂養(yǎng)，6周時(shí)大鼠動(dòng)脈內(nèi)膜便有明顯增厚，大量泡沫細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，10周時(shí)形成典型纖維帽．成功建立大鼠AS模型。此方法建立AS大鼠模型的優(yōu)點(diǎn)在于能夠人為控制AS的形成或病變部位．比較有利于對AS的并發(fā)癥腦卒中的研究，但此種造模方法的缺點(diǎn)是對實(shí)驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求較高，且手術(shù)中的不穩(wěn)定因素較多，在大鼠造模中的個(gè)體差異較大，不易形成穩(wěn)定的AS病變和統(tǒng)一的AS模型。 ApoE基因敲除小鼠構(gòu)建AS模型 血脂異常是AS的主要危險(xiǎn)因素，ApoE是血漿脂蛋白的重要成分，對脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝發(fā)揮重要作用。有研究者用飼養(yǎng)8周齡的載脂蛋白E基因敲除雄鼠給予高脂飼料（脂肪15%、膽固醇1.25%、0.5%膽酸鹽）飼養(yǎng)8周，表現(xiàn)為TG、TC、和LDL-C顯著升高（p＜0.05），HDL-C（p＜0.05）顯著降低，主動(dòng)脈形成明顯的AS斑塊。 效果評價(jià) 從AS的發(fā)病機(jī)制出發(fā)，脂類沉積、血管鈣化、炎癥、免疫機(jī)制或機(jī)械損傷引起內(nèi)膜受損是建立大鼠AS模型的前提．各種構(gòu)建AS動(dòng)物模型的方法在模型形成時(shí)、動(dòng)脈硬化程度及病變發(fā)展上都有所不同。應(yīng)根據(jù)研究目的來選擇。 就以上所述的幾種建模方法而言，純高脂飼料喂養(yǎng)很難導(dǎo)致AS病變，且造模周期較長；高脂飼料結(jié)合維生素D誘導(dǎo)只是導(dǎo)致大鼠形成AS早期的病理狀態(tài)．并沒有形成成熟的與人類病變相似的AS斑塊；大鼠高脂飼料喂養(yǎng)及維生素D損傷的同時(shí)，結(jié)合手術(shù)機(jī)械損傷作用可形成與人類AS相似的較成熟的AS斑塊�；趯poE基因敲除小鼠AS模型的構(gòu)建及相關(guān)研究，有利于更深入的研究疾病的發(fā)生機(jī)制。 隨著研究學(xué)者們對AS的不斷深人了解與探究，相信一定會(huì)有一種比較完美的規(guī)范的與人類病理狀態(tài)相似的動(dòng)物AS模型。 來源： [1]梁璐,洪瑞云,周敏,張毅,鄒海林,鐘一鳴,王烈峰.ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型構(gòu)建[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2017,37(03):337-342+364. [2]王淑琪,李慧,楊曉強(qiáng),白云綺,林繄依,高照,孫克寒,聶波.建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2020,17(12):45-48+68. |
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