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8145新蟲 (小有名氣)
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【求助】金葡菌生物被膜的結晶紫半定量實驗測得OD值很低 已有1人參與
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【求助】金葡菌生物被膜的結晶紫半定量實驗測得OD值很低 小弟最近在做細菌生物被膜的實驗，因為并不是生物專業(yè)，所以好多基礎的問題都不太會。現(xiàn)在是半定量結晶紫染色的結果一直不明朗，還請各位大佬解答一下，結果配圖。實驗步驟如下： 1.將凍干粉金黃色葡萄球菌CMCC26003用復蘇溶液溶解，吹打均勻后將其接種到TSA培養(yǎng)基上37℃過夜培養(yǎng)。 2.傳代到第四代 3.將TSA培養(yǎng)基上的單個菌落（第四代）接種到TSB培養(yǎng)基上，50r/min，37℃，搖菌過夜 4.將菌液吸出，分次少量加入TSB溶液，取100ul到96孔板中，測吸光度結果，直到酶標儀結果為OD600=0.5（用平板計數(shù)法測得菌的濃度在109CFU/mL左右） 5.稀釋到106 ，加200ul菌液到96孔板（聚苯乙烯，TC處理）中，37℃，靜置培養(yǎng)24H。 6.將菌液吸出（顏色由剛開始的澄清變渾濁）后，用PBS緩沖液沖洗三次，晾干 7.加入200ul甲醇，固定30min后棄掉甲醇，用三蒸水清洗三次，晾干 8.加入200ul0.1%結晶紫溶液，染色15min，用三蒸水將多余染料清洗干凈（清洗3-4次）晾干（這個時候效果就不好了，壁上幾乎沒有，底部若有如無） 9.加入200ul33%乙酸，靜置1h后測OD595酶標儀結果，結果在0.08左右 文獻中的酶標儀結果都是我結果的幾倍，甚至是十幾倍，染色后顏色也比我的深非常多�？嘤谶@個結果太久，做到現(xiàn)在已經(jīng)不知道該怎么改進實驗了。今天又懷疑是TSB溶液的原因，我用的是青島海博的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）。跪求做過此種實驗的大佬解答！ 配圖是剛染完色之后。 微信圖片_20220704152708.jpg |
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