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【技術(shù)經(jīng)驗(yàn)】如何獲得高質(zhì)量的細(xì)胞上清液外泌體？
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收到不少的同學(xué)咨詢?nèi)绾潍@得高質(zhì)量的細(xì)胞上清液外泌體？這里給大家講解一些我的經(jīng)驗(yàn)，可以用來提高外泌體的質(zhì)量，供大家參考使用。 首先，從細(xì)胞的培養(yǎng)過程下手。外泌體來自細(xì)胞，因此必須先從源頭抓起。 大部分的細(xì)胞培養(yǎng)過程中都是帶有血清的，無論是牛血清、馬血清等都是含有異源外泌體的，而我們研究的目標(biāo)通常是細(xì)胞所分泌的外泌體，因此需要盡可能的去除這些異源外泌體的干擾。那么我們需要怎么做呢？ 這里需要了解一個(gè)大原則：在細(xì)胞正常生長的條件下，盡可能的減少血清外泌體或者不使用血清。方法一，可以通過超速離心的方法去除血清中外泌體，具體操作可以閱讀“無外泌體血清的制備”，實(shí)在不行就購買商業(yè)化的去外泌體血清。方法二，通過外泌體專用無血清培養(yǎng)基來替代完全培養(yǎng)基，維持細(xì)胞一段時(shí)間的生長后收集細(xì)胞上清液。但是這兩種方法都會存在一定的不足的，去外泌體血清難以做到100%的去除的，因此即使1%的血清外泌體殘留也帶來大量的異源外泌體，而外泌體專用無血清培養(yǎng)基，也不是適合所有的細(xì)胞，常見的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)通常都可以維持生長，而那些血清培養(yǎng)都困難的細(xì)胞就難以通用了，所以也需要一些預(yù)實(shí)驗(yàn)的摸索。 還有，那些DMEM、1640、F12的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是否可以替代血清或者外泌體專用無血清培養(yǎng)基呢？這樣是不行的。因?yàn)榧?xì)胞在這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的環(huán)境下，是處于饑餓狀態(tài)的，細(xì)胞會將培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)（包括外泌體）全部消耗掉的，這時(shí)的上清液中的外泌體含量大幅度下降。 接著，從細(xì)胞上清液的預(yù)處理下手。拿到細(xì)胞上清液收集后該如何處理呢？這是一個(gè)常見問題。我們先要弄清楚細(xì)胞上清液中會有什么物質(zhì)？除了我們感興趣的外泌體外，還有少量細(xì)胞、細(xì)胞碎片、游離蛋白、脂類等。我們首要做的就是通過差速離心盡可能的去除一些雜質(zhì)物，先用800-1000g左右的離心力10分鐘有效去除細(xì)胞殘留，取上清后，再8000-10000g離心10分鐘有效去除細(xì)胞碎片物，這時(shí)候的上清液就可以進(jìn)行保存了。短期3-4天左右使用的話，則可以放到4℃的冰箱中，而長期個(gè)把月后使用的話，則在-80℃進(jìn)行保存，使用前取出來4℃自然融化即可。那么這些離心操作是否可以不做呢？ 不可以的。細(xì)胞上清液處理的越早越好，處理晚時(shí)存留細(xì)胞會壞死而破碎，更多的胞內(nèi)囊泡就會釋放出來了，這時(shí)候的樣品就更加的復(fù)雜了，更不利于后期的研究了。 然后，針對細(xì)胞上清液的初步濃縮。之前在做技術(shù)答疑時(shí)，并沒有建議做初步的濃縮操作，但是后來越來越多的同學(xué)遇到在細(xì)胞外泌體提取過程中無論采取什么樣提取方法都很難看到外泌體沉淀，心中就沒了譜，下游的檢測項(xiàng)目做的更是提心吊膽。因此，在這里給出了通過超濾方法進(jìn)行濃縮處理的建議。超濾的原理就是利用一定的尺寸大小的濾膜攔住大顆粒物而放過小顆粒物的原理，在離心管中最終呈現(xiàn)上液和下游，我們在根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康母魅∷�。針對�?xì)胞上清液的特點(diǎn)，建議可以使用10 KD-100 KD之間的超濾管來進(jìn)行樣品濃縮，外泌體通常是在超濾離心管的上室中，濃縮倍數(shù)控制到5倍左右；針對干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等可以將濃縮倍數(shù)提升到10倍左右，因?yàn)檫@些細(xì)胞外泌體分泌量相對腫瘤細(xì)胞來說要少很多。 最后，針對細(xì)胞上清液的外泌體的提取。這個(gè)是老生常談的問題，這里就不再多講了。如果實(shí)驗(yàn)室有超速離心機(jī)的話，那就使用超速離心的方法，按照前文建議的預(yù)處理操作后，超離后的沉淀也會增加的，同時(shí)外泌體的質(zhì)量也會提升。如果實(shí)驗(yàn)室沒有超離的情況下，也可以通過試劑盒的方法來提取，除了進(jìn)口品牌外，也可以使用一些國產(chǎn)試劑盒，質(zhì)量也不亞于進(jìn)口品牌的。 總結(jié)一下，為了獲得高質(zhì)量的外泌體：需要在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)減少正常血清的使用，推薦去外泌體血清或者外泌體專用無血清培養(yǎng)基；收獲到了細(xì)胞上清液時(shí)，依次離心去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片后進(jìn)行存儲；通過超濾方法濃縮上清液體積，提高外泌體濃度；最后通過超離或者試劑盒的方法提取外泌體。 以上的方法針對制備科研級別的外泌體質(zhì)量會大有提升，如果要針對大規(guī)模（幾升以上）的則需要結(jié)合其他的方法來操作，更多[url=https://www.judeantai.cn/productinfo/1048066.html]外泌體技術(shù)問題可以再進(jìn)行交流。 轉(zhuǎn)載自高博科學(xué)網(wǎng)博客 |
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tzynew2樓
2022-06-13 16:33
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